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目的脑胶质瘤是最常见的颅内原发恶性肿瘤,发病率逐年上升,致残率和死亡率较高,亟需新的诊治手段。其诊治主要面临以下问题:1)现有影像检查手段难以在发病或复发初期及时诊断,患者因此失去了根治性手术、放疗的机会;2)血脑屏障阻碍了大部分有抗瘤活性的药物进入肿瘤组织,局部无法达到有效药物浓度,疗效无从谈起。安全且能够穿过血脑屏障(blood-brain barrier)的载体系统为克服上述困难带来了新的希望,外泌体(exosomes,Exos)具有较强的负载和跨血脑屏障的能力,是有潜力的新型脑靶向递药载体。本研究以小鼠巨噬细胞Raw264.7来源的外泌体为载体,经神经纤毛蛋白-1(NRP-1)的靶向性多肽RGE修饰并在内部负载姜黄素(Cur)和超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION),构建并制备了针对脑胶质瘤的靶向性复合外泌体(RGE-Exo-SPION/Cur)。该复合外泌体理论上能够穿过血脑屏障对脑胶质瘤进行靶向成像和治疗,并能通过磁热疗、药物治疗及二者的协同作用抑制胶质瘤细胞生长。本研究从细胞与裸鼠原位瘤模型水平分别对上述设想进行验证,为脑胶质瘤的诊治策略及外泌体在肿瘤诊疗中的应用提供新的思路和实验依据。方法1.Exos提取、表征:收集Raw264.7细胞上清液,采用“超滤序贯差速超速离心”的方法提取外泌体。所得提取物分别采用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)、纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法、蛋白免疫印迹(westren blot,WB)、激光共聚焦显微镜(laser confocal microscope,LCM)观察等方法进行表征,测量其形状、大小、浓度、电荷、总蛋白含量及膜表面特征性蛋白表达。并观察不同混悬液p H值、储存温度、冻融次数、储存时间等对外泌体的影响;采用高通量测序技术及亲和纯化-质谱分析分别分析其RNA组学和蛋白质组学信息。2.RGE-Exo-SPION/Cur的制备与表征:制备步骤如下:1)“电穿孔→点击化学(叠氮炔环加成反应)”序贯法,制得RGE-Exo-SPION/Cur。通过荧光显微镜(fluorescence microscope,FM)观察、LCM观察、流式细胞分析(flow cytometry,FCM)等方法验证RGE肽连接成功,采用紫外-可见光分光光度法(ultraviolet visible spectrophotometry,UVS),结合RGE肽的吸光值标准曲线,算出连接至外泌体膜表面的多肽的量和浓度。然后通过TEM观察、普鲁士蓝染色(prussian blue staining,PLS)观察SPION,LCM观察Cur,证明负载成功。采用菲啰啉分光光度法测定SPION浓度、UVS测定Cur的浓度。3.RGE-Exo-SPION/Cur对脑胶质瘤的靶向能力评价:首先,采用WB测定U251细胞和Bel-7404细胞上NRP-1蛋白的表达情况,采用LCM观察、FCM评价其对胶质瘤细胞的体外靶向能力;采用活体荧光成像仪观察其在荷瘤鼠体内的分布情况,评价其对原位移植瘤的体内靶向能力。4.RGE-Exo-SPION/Cur对脑胶质瘤的靶向成像功能:细胞水平,RGE-Exo-SPION/Cur与U251细胞、Bel7404细胞孵育后,收集细胞行核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)观察增强效果;胶质瘤原位模型水平,RGE-Exo-SPION/Cur经尾静脉注射入荷瘤鼠体内,行原位瘤MRI检查,观察肿瘤显示范围、边界及增强效果。5.RGE-Exo-SPION/Cur对脑胶质的靶向治疗功能:在体外,通过细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)法测细胞活力;在活体,MRI观测肿瘤长、短径并根据公式计算出肿瘤体积;肿瘤离体后行组织切片病理检查,观察RGE-Exo-SPION/Cur进入脑胶质瘤组织的能力(初次注射后4h)和对脑胶质瘤的抑制作用(治疗开始后第10 d),综合评价RGE-Exo-SPION/Cur对脑胶质瘤的靶向治疗效果。6.RGE-Exo-SPION/Cur的体内安全性评价及荷瘤鼠生存期观察:在开始治疗后第15天从每组中各挑选3只,抽取静脉血检测肌酸激酶同工酶Creatine kinase-MB,CK-MB)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)和血清肌酐(serum creatinine,Scr),以反映主要脏器(心、肝、肾)的功能变化,评价RGE-Exo-SPION/Cur的体内安全性。待荷瘤鼠自然死亡时,记录各组生存时间,评价RGE-Exo-SPION/Cur治疗组的生存获益。结果:1.TEM下,细胞上清超离提取物呈圆形或类圆形的茶托样/杯状结构,具有明显的膜结构,直径在70 nm左右,均一性较好;WB提取物表达外泌体特征性膜蛋白CD63和CD81;NTA显示粒径分布峰值为113.2±4.2 nm。储存24h后,Exos分别在p H=7.4的PBS溶液中、4℃条件下最稳定,且随着冻融次数增加Exos浓度逐渐下降,超过3次后显著下降;而随着储存时间延长,Exos浓度逐渐降低,按上述p H值储存4w后,-80℃条件下,Exos浓度维持最好。经RNA组学及蛋白组学分析可知,所得Raw264.7细胞来源外泌体纯度较高,可以作为体内药物载体,同时印证了文献报道的组成和功能特点。但作为药物载体进行治疗实验时,需严谨的实验设计并持续观察其可能引起的毒副作用。2.TEM下观察RGE-Exo-SPION/Cur仍呈圆形、类圆形膜状结构,粒径较均一,内部可见SPION颗粒,大多聚集在膜内侧;WB显示膜表面有CD63及CD81蛋白表达;NTA显示粒径分布峰值为:122.7±6 nm,zeta电位:-26.1±3.2 mv,浓度为1×1012/m L。RGE连接及SPION/Cur负载均得以证实,RGE-Exo-SPION/Cur连接多肽的平均浓度为:98 n M,每个Exos膜表面连接的RGE肽数约为52个,SPION的浓度为:4000 ug±20 ug/1000 ug Exos/1m L,Cur的浓度为:4000 ug±35 ug/1000 ug Exos/1m L,-80℃放置4周稳定性良好。3.WB证实NRP-1在U251细胞呈高表达,而在Bel-7404细胞则近乎没有表达。CFM及FCM观察发现,RGE-Exo比free-Exo能更多地进入U251细胞而非Bel-7404细胞。将CM-Di I和经CM-Di I标记的RGE-Exo、free-Exo分别经尾静脉注射至荷瘤鼠体内,经活体成像发现,RGE-Exo更早(<1h)、更久(>8h)、更多(P<0.05)地在瘤内聚集,而在肝脾等器官则分布较少、代谢较快。与free-Exo相比,RGE-Exo对脑胶质瘤靶向能力显著增强。4.在各处理组中,RGE-Exo-SPION对U251细胞的MRI负性增强效果最为明显。同时,RGE-Exo-SPION经尾静脉注射荷瘤鼠后,显示最佳的增强效果,可以清晰地显示原位瘤的形状和边界,并与周围正常组织明显分开,在RGE-Exo-SPION/Cur处理组也看到同样的效果。5.细胞抑制实验中,在MFH治疗组,RGE-Exo-SPION可以靶向性抑制U251细胞生长,其效果接近于free-SPION的抑制程度(P>0.05),明显强于free-Exo-SPION(P<0.05);在Cur治疗组:观察到了与MFH组相似的结果;MFH/Cur联合治疗组:SPION介导的磁热疗和Cur介导的药物治疗均明显抑制靶细胞U251生长,二者联合应用时,呈协同作用,RGE-Exo-SPION/Cur的抑制作用显著增强(P<0.05)。原位移植瘤治疗实验中,RGE-Exo-SPION/Cur组对肿瘤的抑制最明显(P<0.05),RGE-Exo对肿瘤生长无作用,free-Exo-Cur、free-Exo-SPION、free-Exo-SPION/Cur、free-SPION、free-Cur组虽然肿瘤较PBS及RGE-Exo组略有缩小,但仍较治疗前显著增大(P<0.05)。6.RGE-Exo-SPION/Cur治疗期间,治疗组裸鼠血清中CK-MB、AST、Scr均无明显异常(P>0.05),荷瘤鼠耐受性良好;生存期方面,治疗组中RGE-Exo-SPION/Cur生存期最长,而其余各治疗组,生存期较对照组(PBS和RGE-Exo)并未延长(P>0.05)。结论1.“差速超速离心”法所得Exos具有和文献报道相一致的典型特征,且产量和纯度均较高,与单一的提取方法(超滤或者差速超速离心)相比,联合法效率更高,对于后续实验对Exos数量和浓度有较高要求的研究来说,是一种可行、高效的提取方法。本研究发现混悬液的p H值、储存温度、储存时间及冻融次数是影响Exos浓度的主要因素。2.“电穿孔载药→点击化学连肽”序贯法所得RGE-Exo-SPION/Cur仍较好地保持了Exos的完整性和特征;经优化反应条件,RGE-Exo-SPION/Cur可连接足够数量的RGE肽、负载足够浓度且比例适宜的SPION和Cur,为后续靶向能力及成像、治疗功能的发挥奠定了基础。此外,该复合Exos还具有稳定性好的优点,可在-80℃储存至少4周。3.RGE-Exo-SPION/Cur可以增强胶质瘤细胞及原位移植瘤的MRI成像效果,能够更早、更清晰地显示肿瘤;RGE-Exo本身不影响肿瘤生长,负载SPION或Cur后,在体内、外均能抑制胶质瘤生长;且无论体外还是体内,MHF和Cur联合治疗组抑瘤作用最强,二者具有协同作用。RGE-Exo-SPION/Cur体内应用安全性良好,抑瘤效果的优势可以最终转化为生存期的延长。