玻璃体后脱离（Posterior Vitreous Detachment,PVD）是糖尿病视网膜病变和视网膜静脉阻塞的常见并发症,老年及近视人群中也有较高的发病率。玻璃体切割、视网膜复位是有效治疗手段,但手术并发症较高,效果不够理想。不少临床研究表明:手术前,以少量纤溶酶降解玻璃体与视网膜连接处蛋白质,可明显减少手术引起的视网膜出血、脱离等并发症。视网膜静脉阻塞是仅次于糖尿病视网膜病变的第二大视网膜血管疾病,是导致视力丧失的主要原因之一。目前的系统溶栓疗法虽起到一定的治疗效果,但易引起广泛的出血,不宜推广应用。且临床使用的溶栓药物多为纤溶酶原激活剂,需激活纤溶酶原（Plasminogen,Plg）为纤溶酶（Plasmin,Plm）后才能发挥溶栓作用。然而,由于栓塞局部的纤溶酶原无法得到及时补充,从而使溶栓效果不理想,血管再通率不高。本研究研制微小纤溶酶防治眼科疾病。人纤溶酶是丝氨酸蛋白酶超家族的成员之一,不仅可降解血栓中的纤维蛋白,发挥溶栓作用,而且还可降解细胞外基质,参与炎症、组织重建、排卵、肿瘤细胞浸润与转移等多种生理、病理过程。人纤溶酶原是一种由791个氨基酸残基构成的糖蛋白,分子量约92 kDa。在碱性条件（pH 11.0）下,纤溶酶限制性降解纤溶酶原Arg⁵³⁰-Lys⁵³¹位上的肽键,生成含261个氨基酸残基的微小纤溶酶原（microplasminogen,μPlg）。它不包含人纤溶酶原N端多肽、五个同源的三角区（K₁-K₅）,但保留了纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶（SP）活性区,可被纤溶酶原激活剂激活后形成微小纤溶酶,具有纤溶活性,受α₂-抗纤溶酶（α₂-antiplasmin,α₂-AP）的抑制作用很小。本实验室采用蛋白质工程技术构建了含人纤溶酶原546-791位间246个氨基酸残基的重组人微小纤溶酶原（recombinant human microplasminogen,rh-μPlg）编码序列的表达质粒,转化甲醇营养型壁赤酵母GS115,获得了rh-uPlg高效分泌性表达。本研究在已获得rh-μPlg高效表达菌的基础上,建立了快速、简便、高效的中试工艺。采用7.5L发酵罐,工程菌密度OD₆₀₀在200以上,发酵液经超滤、凝胶过滤和离子交换层析三步纯化,可获得纯度为95%以上的rh-μPlg,产率达200mg/L培液。还原性SDS-PAGE显示rh-μPlg表观分子量为32kDa,质谱测定其分子量为27 787 Dalton,等电点为pH 7.5-7.8。经尿激酶激活后,以三肽底物S₂₃₉₀（NH2-D-Val-Phe-Lys-p-nitroanilide）测定比活性为23.6 U/mg,Kcat/Km为127.87±0.01 mM^-1·s^-1,而人血浆提取的纤溶酶原的比活性、Kcat/Km分别18.2 U/mg,94.15±0.03 mM^-1·s^-1。将得到的rh-uPlg纯品在体外与重组人组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）以摩尔比200:1比例混合,37℃孵育40分钟,注入于兔眼玻璃体腔后部,分别在注药后1天、7天,以扫描电镜、大体检查、眼部B超及相干光断层扫描（OCT）检测完全性玻璃体后脱离的发生。结果表明:玻璃体腔注入0.5、1.0、1.5U微小纤溶酶后1天,可分别诱导25%、75%、82.5%的兔眼后极部、赤道部玻璃体皮质完全性脱离;玻璃体注入1.0U纤溶酶后1天,可诱导66.7%兔眼完全性玻璃体后脱离。各注药眼在治疗后1天,其视网膜电图a波、b波振幅都出现了显著下降,3天、7天时逐渐恢复,至第7天与对照组无显著差别;而a波、b波的延迟期与对照组皆无显著差异。HE染色显示各注药眼的视网膜内层细胞结构完整,与对照眼无明显差别。SD大鼠实验研究显示了同样的结果。免疫荧光组织化学检测显示:SD大鼠对照眼玻璃体视网膜界面纤连蛋白（FN）主要分布于内界膜与玻璃体后皮质的锚合位点,层粘连蛋白（LN）除分布于锚合位点以外,还均一分布于内界膜的致密板或透明板。在微小纤溶酶诱导的完全性玻璃体后脱离大鼠眼中,玻璃体与视网膜间锚合位点处的FN、LN被降解,而致密板或透明板中的LN无明显降解。表明:微小纤溶酶对SD大鼠玻璃体与视网膜间锚合位点FN、LN的降解诱导完全性玻璃体后脱离。玻璃体内注射微小纤溶酶溶栓尚能有效治疗视网膜静脉阻塞。用光化学法建立SD大鼠视网膜静脉阻塞模型。激光照射后1小时,眼底观察及视网膜血管造影皆显示视网膜静脉血流中断。造模后1天,组织化学检测证实阻塞部位有血栓形成,周边组织排列紊乱,透射电镜显示双极细胞、神经节细胞皆发生了自溶。对造模成功的大鼠,玻璃体内注射0.04U微小纤溶酶,7天后视网膜血管造影显示血管再通率为75%,显著高于rt-PA组及对照组的25%和12.5%。眼底观察、组织化学检查分别显示玻璃体出血大部分吸收、视网膜水肿消退。上述药效学研究证明重组人微小纤溶酶可治疗多种眼科疾病,具有广阔的应用前景。