研究背景脊柱的基本运动单位和功能整体是腰椎的上、下关节突及腰椎间盘组成的“三关节复合体”,当承担不同形式的能量载荷时可以均匀的将应力向各个方向传递和分布。蠕变、应力松弛和滞后现象是椎间盘具有粘弹特性的特殊表现。椎间盘的纤维环在整体上呈现同心圆排列,由25个辐射轮毂状纤维格构成,交联构成网状结构。纤维环的外层富含Ⅰ型胶原,内侧纤维环含有较多的蛋白多糖、但纤维索条较髓核密集,髓核富含Ⅱ型胶原。Ⅰ型胶原含量从外向内呈阶梯样下降,Ⅱ型胶原含量从外向内呈阶梯样增加。正常人体的椎间盘纤维环胶原是由60%的Ⅱ型胶原和40%的Ⅰ型胶原构成,其他类型的胶原含量较少,它们使得椎间盘弹性绝佳。在脊柱负担重力负荷时,髓核把重力均匀分散于各个方向,纤维环的这种特殊结构可以最大限度的保护椎间盘结构的完整。水、蛋白多糖、胶原等是椎间盘重要组成部分,构成细胞外基质的框架。常见的椎间盘细胞：脊索细胞,类软骨细胞,纤维细胞和软骨细胞。随着年龄的增长,脊索细胞数量进行性下降,纤维细胞和软骨细胞逐渐增多,老年人的髓核内脊索细胞基本消失。这些细胞填充包埋在细胞外基质框架内。聚合蛋白多糖(PG, proteoglycan)具有吸水性,维持一定的容积,保持细胞基质框架的体积；PG为负离子携带体,它的数量和单位体积密度变化可以控制椎间盘与周围组织的渗透压变化,进而影响椎间盘细胞外基质的各种生理代谢。随着时间推移,椎间盘椎间逐渐老化,脊索细胞减少,生理代谢平衡难以维持,分解代谢增多,细胞数量逐步减少。腰背部疼痛是影响人们生活质量的常见疾病之一,腰椎间盘退行性变是其主要病因,为研究其发病机制及治疗方法,必须找到一种可靠、易重现、易操作、经济、与人类相识度高的腰椎间盘退变动物模型制作方法。手术治疗和保守治疗是目前治疗腰椎间盘突出症的两大措施。手术为创伤性操作,脊柱的完整性和和稳定性受到影响,而保守治疗通常短期效果较好而长期效果不佳。生物学治疗是逆转椎间盘退行性变,恢复其生物学功能,从而达到治疗目的。通过调解基因导入椎间盘细胞内能够长效的调节椎间盘基质代谢。转基因治疗椎间盘退行性变是Wehling1997年提出的想法。后来发现腺病毒介导的hTGF β 1基因可以导入兔椎间盘中并长期有效表达,有效表达时间超过3个月。腺病毒被Nishida等于1999年介导TGF β 1进行了椎间盘退行性变基因治疗的研究,发现治疗基因可以获得高转染率及高水平基因表达。腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)比腺病毒免疫原性更小,可受周围基因的调控,可以感染分裂期和非分裂期的多种细胞。腺相关病毒介导的Lac2Z基因可以成功转染入兔椎间盘细胞,尽管其转染效率比腺病毒载体低,但其体内(in vivo)、体外(in vitro)试验均获得了成功,这由Lattermann等人于2005年证实。研究目的通过纤维环16G针头穿刺的方法建立一种羊椎间盘缓慢退行性变动物模型；观察腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)载体能否在山羊退变椎间盘体内安全有效的表达；观察腺相关病毒介导的成骨蛋白-1(osteogenic protein, OP-1)基因体内转染羊退行性变椎间盘的细胞后有效持续表达对退变椎间盘的修复效果；观察腺相关病毒介导的人血管内皮生长因子基因体内转染能否有效持续表达并促进退变椎间盘修复；观察腺相关病毒介导的OP-1基因联合hVEGF基因体内转染羊退行性变椎间盘的细胞后能否有效的持续表达,并对退变椎间盘的产生更佳的修复效果。研究方法1动物分组：88只清洁级山羊(specific pathogen free, SPF),抽取4只作为备用动物为H组；A组,8只动物为AAV -OP-1注射组；B组,8只动物为AAV -VEGF注射组；C组,8只动物为AAV -OP-1联合AAV -VEGF注射组；D组,8动物为磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)注射组(安慰剂,对照组)；E组,4只动物为AAV-EGFP注射；F组,8动物为单纯针刺造模组；G组为剩余的8只动物,也做手术,但不损伤椎间盘。即G组和H组的动物椎间盘是完整的。2制作纤维环针刺动物模型。排除G组和H组,将剩余的76只动物来做退变动物模型。在全麻下,采取侧俯卧位,经腹膜外入路显露椎间盘,任意选相连的3个椎间盘,用16G针头穿刺纤维环,穿刺点位于纤维环中央偏左侧平行于下位椎体的上终板并控制其深度为10mm、旋转180度。用黑色缝在相应椎间盘的横突作标记。3动物体内椎间盘基因转染(A、B、C、D、E组)。时间为造模后第4周(28天)。采用相同的手术入路。A组动物造模间盘用27G针头的显微注射器各注射50ulAAV-OP-1(1×1012vg/L)；B组动物造模间盘注射50ul AAV2-VEGF(1×1012vg/L)；C组造模间盘各注射50ul AAV-OP-1和AAV-VEGF(1×1012vg/L)；D组造模间盘各注射50ul PBS:E组造模间盘各注射50 ulAAV-EGFP(1×1012vg/L)、造模后6周(42d)、8周(56d)、12周(84d)、16周(102d),OP-1、VEGF、双基因联合、空白对照组每组分别杀死4只动物,F、G组每组分别杀死2只动物,取得造模间盘；造模后16周处死E组4只羊,收获椎间盘组织。4影像学观察,分别于0周、4周(28d)、6周(42d)、8周(56d)、12周(84d)、16周(102d)拍摄腰椎正侧位DR平片,应用PACS系统做数据统计与分析。5组织学观察,采用HE染色、SafranineO染色、Masson染色、免疫组化等方法,定性、定量观察椎间盘退行性变的发展变化。6生物化学检测,采用免疫荧光、免疫印迹Western-Blot法检测等定性、定量观察基因表达的生物学效应。7.统计数据。采用SPSS17.0进行统计学分析,单因素方差分析,数据以±SD表示,p<0.01认为差异有显著统计学意义,p<0.05认为差异有统计学意义。研究结果1.影像学分析结果：OP-1组动物的造模椎间盘高度大于空白对照组,其%DHI与空白对照组有明显差异(P<0.05),双基因联合组的造模椎间盘高度恢复的最佳,其%DHI与空白对照组有显著差异(P<0.05),VEGF组和F组动物的造模椎间盘高度均持续下降,与空白对照组数据相似,其%DHI与空白对照组数据分析,均无明显统计学意义(P>0.05)。2.Ⅱ型胶原免疫组化染色：OP-1组动物的造模椎间盘髓核内的Ⅱ型胶原含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组,在16周时差异最显著,其Ⅱ型胶原免疫组化染色的平均光密度值与空白对照组有明显差异(P<0.05),OP-1能在动物体内促进Ⅱ型胶原合成代谢。VEGF组与D、F组动物造模椎间盘髓核Ⅱ型胶原含量在各个时期无显著性差异,VEGF组和F组动物的造模椎间盘Ⅱ型胶原均持续下降,与空白对照组数据相似,其Ⅱ型胶原免疫组化染色的平均光密度值与空白对照组数据分析,均无明显统计学意义(P>0.05)。双基因联合组动物的造模椎间盘髓核内的Ⅱ型胶原含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组,在12和16周时差异最显著,其Ⅱ型胶原免疫组化染色的平均光密度值与空白对照组有显著差异(P<0.01),OP-1与VEGF双基因能显著提高动物体内Ⅱ型胶原的合成代谢。3.Ⅰ型胶原免疫组化染色：OP-1组动物的造模椎间盘髓核内的Ⅰ型胶原含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组,在16周时差异最显著,其Ⅰ型胶原免疫组化染色的平均光密度值与空白对照组有明显差异(P<0.05),OP-1能在动物体内促进Ⅰ型胶原合成代谢。VEGF组与D、F组动物造模椎间盘髓核Ⅰ型胶原含量在各个时期无显著性差异,VEGF组和F组动物的造模椎间盘Ⅰ型胶原均持续下降,与空白对照组数据相似,其Ⅰ型胶原免疫组化染色的平均光密度值与空白对照组数据分析,均无明显统计学意义(P>0.05)。双基因联合组动物的造模椎间盘髓核内的Ⅰ型胶原含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组,在16周时差异最显著,其Ⅰ型胶原免疫组化染色的平均光密度值与空白对照组有显著差异(P<0.01),OP-1与VEGF双基因能显著提高动物体内Ⅰ型胶原的合成代谢。4.35S测定蛋白多糖合成率：OP-1组动物的造模椎间盘髓核内的蛋白多糖含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组,在16周时差异最显著,其35S蛋白多糖合成率与空白对照组有明显差异(P<0.05),OP-1能在动物体内促进蛋白多糖的合成代谢。VEGF组与D、F组动物髓核蛋白多糖含量在各个时期无显著性差异,VEGF组和F组动物的造模椎间盘蛋白多糖含量均持续下降,与空白对照组数据相似,其35S蛋白多糖合成率与空白对照组数据分析,均无明显统计学意义(P>0.05)。双基因联合组动物的造模椎间盘髓核内的蛋白多糖含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组,在12和16周时差异最显著,其35S蛋白多糖合成率与空白对照组有显著差异(P<0.01),OP-1与VEGF双基因能显著提高动物体内蛋白多糖的合成代谢。5. Western Blot法检测Ⅱ型胶原：OP-1组动物的造模椎间盘髓核内的Ⅱ型胶原含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组,在16周时差异最显著,其Ⅱ型胶原蛋白灰度值与空白对照组有明显差异(P<0.05),OP-1能在动物体内促进Ⅱ型胶原合成代谢。VEGF组与D、F组动物造模椎间盘髓核Ⅱ型胶原含量在各个时期无显著性差异,VEGF组和F组动物的造模椎间盘Ⅱ型胶原均持续下降,与空白对照组数据相似,其Ⅱ型胶原蛋白灰度值与空白对照组数据分析,均无明显统计学意义(P>0.05)。双基因联合组动物的造模椎间盘髓核内的Ⅱ型胶原含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组,在12和16周时差异最显著,其Ⅱ型胶原蛋白灰度值与空白对照组有显著差异(P<0.01),OP-1与VEGF双基因能显著提高动物体内Ⅱ型胶原的合成代谢。6.免疫荧光：E组动物在造模椎间盘16周后仍有效表达EGFP。研究结论1. AAV-OP-1和AAV-hVEGF体内转染后可持续表达12周；2. AAV-OP-1转染退变椎间盘可延缓其退变速度；3. AAV-OP-1和AAV-hVEGF有协同效应,双基因联合能更加有效地延缓椎间盘退行性变。