论文部分内容阅读
禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)是一类典型的肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic E. coli, ExPEC),APEC通过呼吸道感染禽类,在呼吸道和肺组织定殖,强毒株能引起肺组织的严重病变和炎症反应,包括气囊炎和肺炎,强毒株可以突破肺脏的免疫防御进入血液,进而引起败血症和多系统混合感染。禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是危害养禽业的细菌性传染病之一,对养禽业造成严重损失,由于当前研究成果不能全面揭示APEC感染禽宿主的致病机制,并且APEC具有血清型多样性特征,目前没有有效防控APEC感染禽宿主的疫苗。本文对APEC 02:K1血清型菌株进行全基因组测序,通过比较基因组分析鉴定APEC基因组特征,对APEC流行毒株进行致病力评价,筛选和鉴定APEC新的毒力因子和转录调节因子,研究结果丰富了对禽致病性大肠杆菌致病机制的认识。1.APEC02:K1血清型菌株IMT5155全基因测序及比较基因组学研究本研究首次对APEC 02:K1血清型毒株IMT5155进行全基因测序,进行比较基因组学研究,分析IMT5155演化关系和基因蓝图,结果表明IMT5155与典型的ExPEC强毒株具有相近的演化关系;通过对IMT5155基因组的毒力岛分析,发现了一个APEC 02:K1血清型菌株特有的基因岛,这个新的基因岛命名为PAI I5515(GI-12);另外,两个六型分泌系统(T6SSs)分别位于IMT5155的基因岛GI-7和GI-16,并且普遍同时存在于ExPEC O1、02和018优势血清型菌株;IMT5155含有两个质粒,其中大质粒p1ColV5155含有多类毒力因子,其影响APEC的致病力;对B2ExPEC泛基因组中毒力因子进行分类和基因分布分析,结果表明B2群ExPEC强毒株基因组中部分类型的毒力因子为APEC/ExPEC特有的毒力因子,比如黏附素、侵袭素、毒素和涉铁系统等;通过4种动物模型对APECO1:K1和02:K1血清型菌株(中国分离株)进行致病力测定,结果表明这些菌株属于强毒株,能引起较强的禽大肠杆菌病,并且能引起大鼠乳鼠的脑膜炎,表明APEC O1:K1和02:K1菌株可能具有人畜共患潜力。2. APEC自分泌黏附素AatB的鉴定和功能分析通过比较分析APEC基因组发现了一个新的APEC自分泌黏附素基因aatB,其碱基序列长度为1017bp,编码一个36.3kDa的蛋白,对AatB结构预测分析证实其具有典型的AT结构域,包含N端信号肽、膜外功能域和C端β折叠跨膜域,基因分布检测表明aatB在APEC分离株分布率为26.4% (72/273),而aatB基因在ECOR D和B2群APEC菌株中分布率较高(接近70%)。本研究构建DE205B aatB的缺失株和互补株,实验证实aatB的缺失会降低DE205B对DF-1细胞的黏附能力和对雏鸭的致病力(LD50),并且降低DE205B在雏鸭肺脏内的定殖能力,而aatB互补株的致病力基本恢复至野生株水平,以上实验结果证实AatB与APEC的致病力有直接相关性,AatB能够影响APEC对宿主细胞的黏附定殖,并且Western blot证实AatB可以激发雏鸭产生对应的抗体。另外,生物被膜实验证实AatB能够介导无F I菌毛E.coli AAEC189生物被膜的形成能力。3. APEC自分泌黏附素UapB的鉴定和功能分析APEC强毒株DE205B编码一个典型的传统AT蛋白UpaB,本研究对该蛋白进行功能鉴定,并构建APEC强毒株DE205B的upaB基因缺失株,结合前期对APEC ATs(AatA和AatB)致病力的研究,构建了基因upaB、aatA和aatB的双缺失和三缺失菌株。PCR检测发现upaB基因在APEC菌株中的分布率为41.9 %,并且主要分布于ECOR B2和D群(分布率～70% );黏附试验证实UpaB介导DE205B对DF-1 cells的黏附,并且UpaB能提高无菌毛菌株AAEC189的凝集和形成生物被膜的能力;与野生株DE205B相比,upaB、aatA和aatB双缺失或三缺失菌株显著降低其对DF-1细胞的黏附能力和对雏鸭早期感染时在肺脏内定殖的能力,伴随着半数致死剂量(LD50)的上升;在DE205B△upaB/△aatA/△aatB早期感染阶段,RT-PCR检测发现该菌株的菌毛黏附素基因(yqiL和yadN)及空泡形成毒素基因vat(编码AT家族蛋白)的转录水平明显高于在体外LB培养时,因此推测在感染过程三缺失菌株DE205B△upaB/△aatA/△aatB试图通过上调毒力因子(YqiL、YadN和Vat)的表达水平以补偿其致病力;实验证实UapB、AatA和AatB均具有免疫原性,疫苗接种相关蛋白对雏鸭具有一定程度上的免疫保护力,因而ATs (UapB、AatA和AatB)可以作为APEC亚单位疫苗的候选对象。4.转录调节因子AutA/AutR调控禽致病性大肠杆菌感染的分子机制禽致病性大肠杆菌(APEC)通过呼吸系统感染禽类宿主,APEC可以迅速地调整毒力相关因子的表达模式以促进对宿主的感染定殖,在这个感染过程中需要特定的转录调节因子参与APEC毒力因子表达调控。这些受调节的毒力因子包含自分泌黏附素和K1荚膜,这两种毒力因子促进APEC黏附定殖于宿主的巨噬/非巨噬细胞,及利于APEC耐受血清杀菌作用。本研究发现并命名了两个新发现的转录调节因子AutA和AutR,基因autA和autR位于DE205B基因组的UpaB基因簇,基因分布检测证实UpaB基因簇主要APEC B2和D群分离株。RT-PCR和β半乳糖苷酶试验证实AutA和AutR共同调控DE205B黏附素UpaB的表达,电泳迁移分析和体外转录试验证实AutA和AutR可以直接与upaB启动子区域结合,AutA可以激活upaB转录,而AutR通过阻碍AutA的活性来抑制upaB转录。不仅如此,转录组分析发现AutA和AutR共同调节APEC 一百多个基因的mRNA转录,受调控的基因表达产物包括黏附素、K1荚膜和酸耐受系统等。进一步研究表明,在APEC与宿主相互作用的时,AutA和AutR共同调节K1荚膜和酸耐受系统的表型异质性表达。本研究证实在APEC与宿主细胞环境互作时,转录调节因子AutA和AutR能互惠型调控黏附素、K1荚膜和酸耐受系统的表达,AutA和AutR能介导DE205B的表型适应力,包括黏附能力、胞内存活能力、血清抗性、雏鸭肺脏内早期定殖和败血症等,AutR和AutR的表型异质性调节能促进APEC的感染。