论文部分内容阅读
背景：胃癌(gastric cancer, GC是世界上最常见的恶性肿瘤之一。2007年全球新发胃癌数1,000,000例,仅次于肺癌、乳腺癌和大肠癌,位居第4位,全球因胃癌死亡800,000例,位居癌症死因的第2位。尽管近年来外科手术、化疗、放疗、免疫治疗等治疗手段取得了长足的进步,但由于缺乏特异性临床表现及有效的早期诊断技术,在接受治疗的病人中很大一部分是进展期患者,而世界范围内进展期胃癌5年生存率仍不足25%。肿瘤复发、转移既是胃癌患者死亡的主要原因,也是影响临床疗效和预后的关键因素。研究胃癌发生、发展、侵袭转移的具体机制,了解胃癌进展过程中可能的分子步骤具有十分重要的意义。Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(Type II transmembrane serine protease, TTSPs)是一大类位于细胞膜上的蛋白水解酶,在上皮-间质转化、恶性肿瘤侵袭转移、肿瘤信号传递中起着重要作用。跨膜丝氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)是TTSPs家族中的一员,近年来的研究发现在胰腺癌中表达增高,功能上具有胰酶活性,可能在肿瘤的转移和侵袭过程中起到重要作用。但TMPRSS4对胃癌细胞侵袭转移能力的影响尚无相关报道。目的：通过检测TMPRSS4在临床胃癌病例及胃癌细胞系中表达情况,分析TMPRSS4表达与胃癌临床病理因素、临床预后和胃癌侵袭转移的相关性。进一步通过质粒构建转染技术抑制TMPRSS4的表达及恢复其表达,研究TMPRSS4调控GC侵袭转移的分子机制。探讨TMPRSS4表达在胃癌发生发展过程中的作用及意义。方法：1.采用qRT-PCR和Western blot方法检测35例新鲜胃癌组织和邻近非癌胃组织中TMPRSS4 mRNA和蛋白的表达情况,分析TMPRSS4 mRNA和蛋白与胃癌临床病理因素的关系。2.采用免疫组织化学法检测108例胃癌组织和108例邻近非癌胃粘膜组织中TMPRSS4蛋白的表达情况,分析胃癌组织中TMPRSS4的表达与胃癌临床病理因素及患者预后之间的关系。3.采用qRT-PCR和Western blot方法检测在AGS,BGC-27,BGC-823 SGC-7901和MGC-803胃癌细胞系中TMPRSS4mRNA和蛋白的表达情况。4.构建特异性TMPRSS4 siRNA表达载体,使用脂质体将其转染过表达TMPRSS4的胃癌细胞系,经G418筛选,获得稳定TMPRSS4表达抑制的胃癌细胞系。通过划痕愈合实验、Transwell侵袭实验、同质性及异质性粘附实验、生长曲线、克隆形成等方法研究TMPRSS4表达抑制调控GC侵袭转移的作用机制。5.构建TMPRSS4过表达载体,使用脂质体将其转染TMPRSS4表达抑制的胃癌细胞,恢复TMPRSS4表达,通过划痕愈合实验、Transwell侵袭实验、同质性及异质性粘附实验、生长曲线、克隆形成等方法研究TMPRSS4过表达调控GC侵袭转移的作用机制。结果：1.与邻近非癌胃粘膜组织相比,胃癌组织中TMPRSS4的阳性表达率明显增多(P<0.01)；胃癌组织中TMPRSS4蛋白表达强弱与胃癌癌灶的大小、浸润深度、肿瘤TNM分期以及淋巴结转移数目有关(P<0.05)；单因素分析显示TMPRSS4蛋白强表达组5年生存率低于弱表达组(P<0.001);Cox多因素分析结果发现TMPRSS4蛋白表达情况也是影响患者预后的独立因素。2.成功构建了TMPRSS4 siRNA表达载体和TMPRSS4过表达载体并且能高效转入MGC-803细胞内。与阴性对照组及空白对照组比较,TMPRSS4 siRNA组中TMPRSS4 mRNA和蛋白表达沉默效率分别达到了68.77%和73.26％(P<0.001)；TMPRSS4过表达组中TMPRS S4 mRNA和蛋白表达明显高于阴性对照组及空白对照组(P<0.01)；与空白对照组和阴性对照组比较,TMPRSS4 siRNA组中细胞的迁移和侵袭能力下降(P<0.01)；TMPRSS4过表达组中细胞的迁移和侵袭能力增强(P<0.01)。结论：1.胃癌组织中TMPRSS4的高表达不仅与胃癌的发展和转移密切相关,也可作为判断胃癌患者预后的指标之一。2.TMPRSS4 siRNA表达载体能有效地抑制胃癌MGC-803细胞TMPRS S4 mRNA及蛋白的表达。沉默TMPRSS4在胃癌MGC-803细胞中的表达可抑制MGC-803细胞迁移和侵袭,增强胃癌MGC-803细胞的同质性粘附,下调FAK、ERK、磷酸化Akt和E-cadherin的表达水平。3.过表达TMPRSS4载体能增加胃癌MGC-803细胞TMPRSS4 mRNA及蛋白的表达并增强MGC-803细胞迁移和侵袭能力。