一、研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,在肿瘤患者的致死率中高居第三位。我国是肝癌的高发国家,发病率约占世界范围的一半以上。肝癌发生迅速,具有极高的转移复发倾向。虽然对于肝癌的基础与临床研究已经获得长足的进展,但是肝癌的疗效总体仍然不佳。对于HCC的发生机制,最普遍的观点是在致癌因素作用下,肝细胞(hepatocyte)发生了基因突变(gene mutation)或者表观遗传学改变而导致癌变(oncogenesis)。然而此种观点尚不能完全揭示肝癌发生及发展的全部机制,因为此类研究主要集中于肝癌细胞本身,而忽视了肿瘤微环境(tumor microenvironment)中间质细胞和肝癌细胞的相互作用。肝癌肿瘤微环境是一个复杂的综合系统,它由许多基质细胞组成,包括肝星状细胞、免疫和炎性细胞、脂肪细胞、胶质细胞、平滑肌细胞以及一些血管细胞等。这些细胞可以被肿瘤细胞诱导,其周围产生大量的细胞因子、趋化因子、细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)或细胞间的直接接触等途径和实质细胞相互作用,影响肿瘤的增殖、转移、新生血管形成以及参与肿瘤免疫等。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝脏主要的间质细胞之一。自Enzan等通过α-平滑肌肌动蛋白染色发现HCC基质中有明显的肌纤维母细胞(myofibroblast,MFB)浸润以来,肝癌微环境中肿瘤细胞与HSC的生物学行为逐渐受到关注。目前,有研究指出肿瘤微环境中的HSC能够显著影响HCC细胞的生物学行为,促进HCC细胞浸润与增殖。近来研究提示HSC活化在HCC的发生、发展和转移中可能起了至关重要的作用,激活的肝性状细胞可以异常分泌一些细胞因子,如IL-8、FGF (fibroblast growth factor)1 / 2、PDGF(platelet-derived-growth-factor)、IGF( insulin-like growth factor)等促进肝细胞癌的进展,但这一过程的全貌仍然不明确。人表皮形态发生素(Epimorphin, EPM, Syntaxin-2)于1992年由Hirai发现,基因定位在12q24.33,基因编码序列为911bp,编码290个氨基酸。EPM在正常肝脏主要表达于肝窦状隙的肝星状细胞(HSC)、汇管区血管和胆管上,通过表皮-间质相互作用介导表皮形态发生,腺管状结构或球状类器官体的形成。肝脏发育过程中,HSC主要通过表面特异性表达的EPM与肝干细胞直接接触而诱导肝干细胞的功能性分化。在某些疾病中,EPM也发挥了作用。Bascom等发现未生育和初产雌性WAP-EPM小鼠发生肺泡异常增生和高分化腺癌,表明EPM参与乳腺正常的形态发生过程改变会导致肿瘤。在我室前期的研究中发现,EPM蛋白在体外可以诱导肝干细胞(WB-F344)向幼稚的胆管上皮细胞分化,并形成管状样结构,此过程和黏着斑的装配形成、β1integrin、应力纤维的排布密切相关。EPM具有调节WB细胞有丝分裂方向(MO)的能力,而抗EPM多克隆抗体可以阻断这种规律性。在进一步的研究中还发现,EPM蛋白诱导肝干细胞(WB-F344)向幼稚的胆管上皮细胞分化的这一过程是通过RhoA and C/EBPβ通路来实现的。Anisa Shaker等人发现在对EPM缺失小鼠的研究中发现,EPM缺失能够减少肌成纤维细胞白细胞介素6(IL-6)的分泌,抑制其诱导产生的炎症反应,并增加上皮细胞的修复而抑制慢性炎症相关性结肠癌的发生。那么在肝癌肿瘤微环境中的星状细胞表达EPM是否发生变化以及可能的机制引起了我们的兴趣。二、研究目的探讨肝星状细胞表达的EPM在肝癌发生、发展中作用,及其发生作用所依赖的分子机制。三、主要研究内容与方法:1. HSC对于HCC细胞增殖能力的影响:利用条件培养基培养的方法检测HSC对HCC细胞增殖能力的影响,裸鼠皮下成瘤实验分析HSC对HCC细胞生长的影响。HSC对HCC细胞浸润与侵袭能力的影响:划痕实验和Transwell实验分析HSC条件培养基对HCC浸润和侵袭能力的影响。2. HSC作用机制的初步分析:RT-PCR、realtime-PCR、western blot检测HSC基因表达;免疫组织荧光染色和western blot方法检测肝癌组织和对照肝脏组织标本中EPM的表达;3. EPM在HSC中表达上调机制的初步分析:利用生物信息学分析EPM启动子去与是否存在CpG岛,分析CpG岛的甲基化状态的改变对基因表达的影响,探讨EPM上调可能的机制。4.RNA干扰技术构建EPM干涉载体,获得稳定干涉EPM的星状细胞,分析EPM干涉前后HSC对HCC生物学特性(增殖、浸润于侵袭)的影响,并利用3D共培养体系观察EPM干涉前后HSC和HCC共培养条件下细胞形态变化。5.EPM影响细胞侵袭能力机制的初步探讨:利用MMP-9的干涉载体,干涉EPM稳定株中MMP-9基因的表达,分析MMP-9干涉前后肝癌细胞浸润能力。四、实验结果1.肝星状细胞能够促进肝癌细胞的增殖、迁移及浸润通过在体外收集条件培养基,我们检测了星状细胞和肿瘤细胞相互之间对于增殖能力的影响,以及星状细胞对肝癌细胞迁移和浸润能力的影响。接下来通过裸鼠皮下成瘤实验,研究了星状细胞在体内对于肝癌细胞增殖能力的影响。通过研究发现,星状细胞和肝癌细胞能互相胡促进彼此的增殖,而且在体内星状细胞能够明显促进肝癌细胞的成瘤能力。肝星状细胞还能够增强肝癌细胞的迁移和浸润能力。2.肝癌细胞能够促进肝星状细胞高表达EPM通过实验证明星状细胞能够在多方面影响肝癌细胞的生物学行为。为了进一步明确表皮形态发生素(Epimorphin)在二者相互作用时发生的变化,我们在体外通过肝癌细胞的条件培养基培养星状细胞后检测其表达EPM水平的变化,分别在mRNA和蛋白水平发现EPM的表达都发生了明显的上调。之后,我们收集了23例肝癌标本与正常肝组织进行比较,对其进行冰冻切片并进行免疫荧光检测EPM和α-SMA的表达。经过实验发现,EPM在肝癌组织中表达明显增强并且表达的部位同α-SMA的表达部位一致。在肝癌微环境中,α-SMA是激活的肝星状细胞的标志。因此,EPM在肝癌组织中表达明显升高,并且EPM表达的细胞为激活的肝星状细胞。3.肝星状细胞高表达EPM可以通过启动子区的去甲基化调控之后,我们进一步用western blot检测了EPM表达的情况,进一步验证了肝癌组织中EPM高表达的这一现象。为了研究星状细胞在肝癌细胞刺激后高表达EPM的这一现象的机制,我们对其进行了表观遗传学检测。实验发现,EPM的表达可以通过基因启动子区CpG岛的甲基化和去甲基化进行调控。4.EPM对于肝癌细胞生物学行为的影响EPM在大部分肝癌组织中高表达,为了研究其在肝癌微环境中的可能作用,我们利用RNA干扰技术对星状细胞的EPM进行了沉默,成功获得了EPM干涉的星状细胞株。之后对其干涉EPM的星状细胞对于肝癌细胞的迁移和浸润能力进行了一些列检测。经过检测发现,EPM沉默之后,肝癌细胞的迁移和浸润能力明显下降。接下来对过表达EPM的97H细胞进行肝脏原位转移实验,结果证明,过表达EPM的97H细胞具有更强的转移能力。因此,肝癌微环境中星状细胞高表达的EPM能够促进肝癌细胞的转移。5.EPM通过MMP-9促进肝癌细胞浸润为了仅以研究EPM促进肝癌细胞转移的分子机制,我们进行了分子信号通路方面的研究。我们构建了MMP-9干涉载体,并通过瞬时转染沉默了过表达EPM的97H和97L细胞的MMP-9的表达。实验发现干涉后的过表达EPM的肝癌细胞浸润能力明显下降。因此,EPM最终可以通过影响肝癌细胞的MMP-9表达而影响肝癌细胞的转移能力。综上所述,本研究验证了肝星状细胞对于肝癌细胞生物学作用的影响,并发现EPM在肝癌组织中高表达,去甲基化能够促进EPM的表达。EPM表达增高后能够显著影响肝癌细胞的迁移和浸润的能力,这种作用主要是通过MMP-9途径产生的。