短暂氧化应激对大鼠内耳的损害及保护前言近年来大量的研究表明：氧化损伤是几乎所有疾病的潜在病因，氧化损伤也是导致药物性耳聋、噪声性聋、突聋和老年性聋的主要原因，导致内耳损伤的氧化应激往往是短暂或短暂、多次累计作用的结果，因此本实验所采用的短暂的氧化应激方式是更具实际意义的研究模式；以往听觉器官损伤的研究靶点大多集中于听觉毛细胞和螺旋神经节神经元上，而本实验的主要研究对象为离体大鼠的耳蜗血管纹，探讨该组织是否为内耳氧化损伤的起始位置和内耳抗氧化损伤的最前沿；研究耳蜗血管纹在短暂氧化应激过程中的细胞形态、功能、分子生物学的改变就可能为今后使用抗氧化损伤的保护剂提供作用的靶点。目前有效治疗耳聋的药物尚待研发，治疗耳聋较为有效的植物中药中大多数为抗氧化剂；天然植物抗氧化成分也是中药异病同治的基础，因此在实验中观察了强抗氧化剂—葡萄籽提取物（低聚原花青素）对自然衰老过程中的大鼠内耳形态、听觉生理及生化方面的退行性改变所产生的影响。为进一步探讨葡萄籽提取物（低聚原花青素）在内耳抗氧化损伤中的作用机理，选取了耳蜗血管纹作为研究靶点，采用半定量的逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术观察短暂的氧化应激和抗氧化剂的保护对血管纹特异性Isk表达的影响，观察血管纹在耳蜗氧化和抗氧化中所到的作用。为氧化损伤及抗氧化剂在内耳的深入研究提供了实验依据。方法一、耳蜗血管纹和Corti器的取材及离体培养取新生7天的Wistar大鼠，消毒后用颈脱法处死，后断头；矢状位平均分成两半，去除脑组织，暴露耳蜗底部骨质，在解剖显微镜下将听泡完整取出，置于所配制的生理溶液中，去除骨壁暴露螺旋韧带，将衬于螺旋韧带内侧壁的血管纹与螺旋韧带剥离，取出完整的血管纹，血管纹特有的毛细血管分布可与耳蜗内的其他相似结构相区别，然后将去除螺旋韧带的耳蜗中的Corti器沿蜗轴逆时针完整取下，从动物处死到Corti器和血管纹完整取出，共需5分钟，因而不影响所取Corti器和血管纹的生物活性，放入培养液中培养，培养在37℃，5％CO₂孵育箱中。二、Corti器和血管纹细胞轮廓的观察将实验组和对照组的血管纹和Corti器固定，用TRITC-Philloidin避光染色，放在正置荧光显微镜下观察并拍照。。三、血管纹细胞核的观察将实验组和对照组的血管纹用PI避光染色，在倒置荧光显微镜下观察是否组织中有细胞核出现，并观察细胞核形态的改变。如果可见PI染色的细胞核，再用TUNEL试剂盒鉴定受损细胞是否为凋亡细胞。操作步骤按照该试剂盒所述步骤进行。四、血管纹内ROS的动态测量在实验组和对照组培养0、10、30、60分钟时将DHR123放入培养液中（终浓度为20uM）在激光共聚焦显微镜下，（激发波长568nm，发射波长615nm，）ROS产生且浓度发生变化时，荧光强度也发生变化，用Adobe Photoshop 7.0 Software做定量分析绘制ROS产量的时间分布图。五、Corti器和血管纹细胞线粒体膜电位的测量在实验组和对照组继续培养30分钟、2小时、8小时后在培养液中加入JC-1染色10分钟后，PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。六、ABR反应阈的测定用药前及用药后6个月各测一次。在隔音的电屏蔽室内常规方法测试ABR，记录反应阈。用Danac-7型声刺激器行短声刺激，频率20次／s，扫描时间10ms，滤波100-300Hz，声输出范围0-100dB，信号叠加128次，以Ⅲ波反应阈为标准判定听阈。七、血清及耳蜗SOD检测用药6个月后，取每只动物血1ml和左耳蜗，测量血清和耳蜗内的SOD。八、RT-PCR检测血管纹边缘细胞Ⅰsk mRNA表达的变化提取血管纹的总RNA：每个实验组和对照组取分别取10个血管纹，按Trizol试剂盒操作说明提取细胞总RNA；测定总RNA浓度、纯度和完整性；逆转录合成cDNA：多聚酶链反应（PCR）。结果一、短暂氧化应激后离体大鼠血管纹和Corti器细胞的损伤1、短暂氧化应激后血管纹细胞的损伤：用TRITC-Philloidin染色观察实验组血管纹细胞在培养后的2小时和8小时后分别出现细胞的浓缩和溶解；用PI处理对照组和实验组的血管纹，对照组在正常培养8小时后PI染色阴性，说明无细胞核损伤，4％多聚甲醛固定后，PI染色见细胞核分布规整，无核形态改变；对实验组培养后2小时、8小时的血管纹用PI染色，观察到与PI结合的细胞核，且有细胞核形态的改变；为进一步确定细胞损伤或死亡形式，用TUNEL试剂盒处理对照组正常培养8小时的血管纹和实验组培养8小时后的血管纹，观察到部分细胞的凋亡。2、短暂氧化应激后Corti器毛细胞的损伤：用TRITC-Philloidin处理对照组和实验组的Corti器，正常培养8小时后对照组Corti器的毛细胞排列整齐无缺失；实验组在继续培养8小时后Corti器毛细胞出现缺失。二、短暂氧化应激后离体大鼠血管纹和Corti器细胞线粒体膜电位的改变1、短暂氧化应激后耳蜗血管纹线粒体膜电位的改变：用JC-1染液处理对照组和实验组的血管纹，观察血管纹内线粒体膜电位的改变，JC-1染液，在线粒体内呈电位依赖式聚集，所以用来探测线粒体膜电位的改变，JC-1聚集在线粒体膜电位较高处，呈红色或橘红色。颜色消失即线粒体膜电位消失。对照组在培养8小时后仍无线粒体膜电位的消失；实验组血管纹细胞内的线粒体膜电位在去除氧化应激后的30分钟、2小时、8小时后逐渐消失。2、短暂氧化应激后Corti器细胞线粒体膜电位的改变：用JC-1处理对照组和实验组的Corti器，对照组的线粒体膜电位在正常培养8小时后的Corti器中存在，且主要集中分布在盖膜区和毛细胞区；实验组的细胞线粒体膜电位在培养2小时后的Corti器中完全消失。三、短暂氧化应激后血管纹内ROS的动态测量在实验组和对照组培养0、10、30、60、120分钟时将DHR123放入培养液中（终浓度为20uM）在激光共聚焦显微镜下，（激发波长568nm，发射波长615nm，）观察荧光强度随时间的变化：对照组血管纹中几无ROS；短暂的氧化应激后的实验组中血管纹内开始产生ROS：0时刻无ROS产生，10分钟时荧光微弱；30分钟后荧光略有增强；60分钟时荧光明显增强接近所观察到的最高强度；120分钟时与60分钟时强度接近。四、在体实验中ABR阈值及SOD的测量1、ABR阈值：用药前，两组ABR反应阈比较，差异无显著性意义P＞0.05；用药后，两组ABR反应阈比较，差异显著P＜0.01；OPC防治组反应阈较自然衰老对照组低。2、血清及耳蜗SOD含量：OPC防治组与自然衰老对照组血清及耳蜗SOD含量相比较，均有显著性差异P＜0.01；OPC防治组血清及耳蜗SOD活性增强。3、耳蜗基底膜外毛细胞的缺失：OPC组和自然衰老对照组耳蜗中间部位均无明显的毛细胞缺失，顶回接近顶端的外毛细胞均有缺失，但两组间无显著性差异P＞0.05；对照组底回外毛细胞缺失约为14％，OPC防治组底回相同部位外毛细胞缺失率约为7％，二者有显著性差异P＜0.01。五、RT-PCR检测离体血管纹细胞Ⅰsk mRNA的表达血管纹细胞可见到ⅠskmRNA于368bp处出现特异性扩增带，正常培养组ⅠskmRNA于368bp出现明显的强扩增带，H₂O₂作用后出现明显减弱的特异性扩增带，H₂O₂+OPC特异性扩增带较H₂O₂作用后明显增强结论1、短暂的氧化刺激可以激发耳蜗内源性ROS的产生，使线粒体膜的完整性遭到破坏，从而导致耳蜗Corti器和血管纹的损伤和死亡。2、长期应用葡萄籽提取物（低聚原花青素）喂食老年大鼠可有效延缓老年大鼠听力的下降。3、短暂的氧化刺激可以使血管纹的特异Ⅰsk mRNA表达减弱，天然植物抗氧化剂—葡萄籽提取物（低聚原花青素OPC），可使因氧化损伤所致的Ⅰsk mRNA表达得到恢复，使耳蜗血管纹受到保护。