背景：致心律失常性右室心肌病(Arrhythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy, ARVC)病变特征是右心室被纤维脂肪组织替代,其中至少一半以上的病人基因筛查发现桥粒突变,但其发病分子生物学机制和替代心肌细胞的脂肪细胞来源尚不清楚。Wnt/β-catenin通路调控第二生心区心肌祖细胞发育分化选择性构成解剖性右室,同时调节心肌细胞分化和脂肪生成。既往动物模型研究认为其信号异常参与ARVC的发生,但仅在细胞和动物模型上证实,并未在人ARVC标本进行研究。由于发病分子机制不清,临床表型多变和组织学变异较大,导致ARVC诊断仍存在困难；心内膜活检Masson染色评估心肌纤维脂肪化比例仍为目前指南推荐的方法,但缺乏特异性组织学标记物导致诊断准确率偏低。因此,很有必要对在人标本上对ARVC发病的分子机制和临床诊断标记物进行深入研究。目的：本研究旨在揭示Wnt通路异常调节使第二生心区心脏祖细胞发育偏离向脂肪细胞转化导致ARVC患者纤维脂肪组织选择性浸润右室的分子机制。假设ARVC心肌组织存在由第二生心区心脏祖细胞向脂肪细胞转化的“过渡态细胞”,筛选在ARVC心肌组织特异表达的“过渡态细胞”作为ARVC诊断标记物,并明确最佳心内膜活检位置。方法：全基因组外显子测序筛选桥粒突变(n=4)和非桥粒突变ARVC (n=4)心脏移植标本,对照组为法医病理学尸检的正常心脏标本(n=8)。电镜观察ARVC与正常心肌细胞连接处桥粒蛋白的完整性。免疫荧光检测ARVC心脏移植标本心肌组织细胞连接带的桥粒蛋白组成之一—盘状球蛋白(plakoglobin, PG)的表达情况,并观察其是否从细胞连接处散落异位进入细胞核。免疫印迹检测PG蛋白在胞质和胞核的分布。免疫共沉淀联合质谱(IP-MS)检测PG蛋白入核后,是否与其分子结构相似地Wnt通路关键分子β-catenin竞争性结合该通路核心转录因子TCF712。免疫荧光和免疫印迹检测β-catenin磷酸化程度,使用IP-MS检测与磷酸化β-catenin结合的蛋白复合体。聚合酶链反应(RT-PCR)检测Wnt通路下游靶基因表达情况；共染第二生心区心脏祖细胞标记物(Islet1,Mef2c)和脂肪转录因子标记物(CEBP-α, PPAR/γ),以检测ARVC心肌组织是否存在由第二生心区心脏祖细胞向脂肪细胞分化的“过渡态细胞”。为筛选出最易检出的“过渡态细胞”类型和活检位置,扩大样本在21例ARVC心脏移植标本取5个常规心内膜活检位置(右室流出道,右室心尖,三尖瓣下,右侧室间隔和左室游离壁)组织,免疫荧光染色筛选最易检出的“过渡态”细胞；免疫荧光和流式细胞检测验证其在ARVC心肌组织表达的特异性。将最易检出的“过渡态细胞”作为ARVC新的诊断标记物,与两种常规方法(心内膜定量活检和PG蛋白信号下降)在5个常规活检位置,在心脏移植标本库中(n=82,21例ARVC,53例其他心肌病和8例正常心脏)比较三种方法诊断ARVC的受试者工作特征曲线(ROC)曲线下面积(AUC)、敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)；从而筛选出诊断ARVC最准确的方法和最佳活检位置。结果：电镜显示桥粒突变型ARVC (DSG2,DSG2, PKP1和PKP3、DSG2)位于心肌细胞连接处的桥粒蛋白受损,免疫荧光显示PG从细胞连接处散落进入细胞核。以TCF7L2为核心蛋白行免疫共沉淀,IP-MS检测蛋白复合体发现PG蛋白入核后与β-catenin竞争性与TCF7L2结合。PG蛋白核异位竞争结合TCF712导致下游多种靶基因转录改变,促进脂肪转录生成相关基因Wnt5b和BMP7表达升高3-4倍；抑制脂肪生成的基因CTGF表达下降2-3倍；促进心肌细胞增殖和更新的基因C-myc、CyclinE1、 CyclinDl表达量明显下降2倍；促进第二生心区心脏祖细胞更新的基因Jag1、Hey1和Hes1表达量较正常组升高2-3倍。部分非桥粒突变型ARVC (TGFβ3, RYR2, TGF β3和TMEM43)超微结构显示细胞连接带相对完整,免疫荧光和免疫印迹检测核蛋白均未发现PG蛋白入核。免疫印迹发现ARVC心肌细胞核β-catenin表达量较正常组低；免疫荧光和免疫印迹发现胞质β-catenin明显磷酸化,胞核磷酸化β-catenin表达较低。IP-MS发现胞质磷酸化β-catenin与泛素化酶复合体Polyubiquitin-C形成蛋白复合体,同时发现介导β-catenin磷酸化降解的糖原合成激酶-3β表达量非桥粒ARVC组较正常组明显升高。β-catenin磷酸化后在胞质降解使其无法入核与TCF712结合,导致Wnt/β-catenin通路下游靶基因出现促进脂肪生成的基因表达增高,抑制脂肪生成的基因表达降低,促进第二生心区心肌祖细胞更新的基因表达增加,促进心肌增殖分化的基因表达下降；介导β-catenin磷酸化的基因Axin2表达增高。免疫荧光和流式细胞检测均发现ARVC心肌组织中存在共表达第二生心区心脏祖细胞标记物(Mef2c, Isletl)和脂肪细胞标记物(CEBP-α,PPAR-γ)的“过渡态细胞”,两类ARVC患者通过“共同通路”促使第二生心区心脏祖细胞发育偏离向脂肪细胞转化导致ARVC脂肪细胞选择性浸润右心室。对21例ARVC心脏移植标本在5个常规活检位置筛选出心肌组织中最常见的“过渡态”为Islet1+/CEBP-α+细胞(86%)。流式细胞术和免疫荧光发现Islet1+/CEBP-α+细胞在ARVC心肌组织特异性表达,而在扩张型心肌病、肥厚型心肌病和正常人心肌组织未见表达。在五个常规活检位置对三种诊断方法在心脏移植标本库比较其诊断ARVC能力后,发现三种方法最佳活检位置均为右室流出道。Islet1+/CEBP-α+细胞在右室流出道诊断ARVC的AUC为0.912,敏感性为0.86,特异性为0.97,PPV为0.90,NPV为0.95,明显优于其他两种方法。结论："Wnt/β-catenin"抑制为ARVC发病的“最后共同通路”,促使第二生心区心脏祖细胞发育偏离向脂肪细胞转化,导致ARVC脂肪细胞选择性的浸润右室。位于右室流出道Isletl+/CEBP-α+“过渡态”细胞是诊断ARVC准确度高的特异组织学标记物；右室流出道为最佳的心内膜活检位置。背景：孤立性左室致心律失常性心肌病(Isolated Arrhythmogenic Left Ventricular Cardiomyopathy, IALVC)病变的基本特征为单纯左室心肌细胞被纤维脂肪组织由外膜向内膜逐渐取代,而右室不受累。桥粒基因突变为其发病的遗传学基础；因其发病率低,标本少见,其确切病理学特征及发病的分子机制尚不清楚。Wnt/β-catenin通路调控左室心外膜祖细胞向间充质细胞转化,促使其由心外膜向心内膜迁移参与心肌损伤修复,同时是心脏中调节心肌生成和脂肪生成平衡的重要通路。目的：描述IALVC的病理学特征及脂肪细胞选择性浸润左心室的分子机制。方法：系统地对4例IALVC移植心脏标本进行大体病理解剖,4例正常心脏和4例左右室同受累的ARVC为对照组,用常规的病理学检查方法评估左右心室扩张程度,并对左右室取材行Masson染色观察两侧心室脂肪纤维浸润的特征。免疫荧光和免疫印迹(分离胞浆和胞核蛋白)检测ARVC心脏移植标本心肌组织细胞连接带的桥粒蛋白组成之一的盘状球蛋白(plakoglobin, PG)的表达情况及其是否从细胞连接处散落异位进入细胞核；免疫共沉淀PG蛋白异位入细胞核后是否与其分子结构类似的Wnt通路关键分子β-catenin竞争性与核心转录因子TCF7]2结合；免疫印迹检测心外膜祖细胞标记物Wtl在正常心肌组织,ARVC和IALVC之间的表达差异。用RT-PCR检测Wnt通路下游与脂肪生成,心外膜祖细胞向间充质细胞转化的调节基因；免疫荧光和流式细胞术鉴定IALVC组织是否存在心外膜祖细胞标记物和脂肪转录因子共存的“过渡态细胞”。结果：IALVC左室脂肪浸润呈独特的由心外膜向心内膜逐渐迁移发展的过程,Masson染色可见IALVC由外向内整层心肌细胞完全被纤维脂肪组织所替代,纤维脂肪组织处少见心肌细胞残留。而双心室同时受累的ARVC可见心肌细胞被纤维脂肪组织所间隔,残留心肌细胞呈“岛状”排列,心肌全层均可见纤维脂肪组织,未见明显由外膜向内膜迁移过程。免疫印迹和免疫荧光可见IALVC左室表达心外膜祖细胞(Wtl),但ARVC左室和正常人心脏左室未见其表达。免疫组化显示与正常组心脏相比,4例IALVC均出现细胞连接处桥粒蛋白组成之一PG信号下降,免疫荧光可见PG异位入核,免疫共沉淀发现IALVC患者PG蛋白与Wnt通路β-catenin竞争与TCF712结合,导致Wnt通路下游心外膜祖细胞向间充质细胞分化的基因表达增强,促进脂肪生成的基因表达增强,抑制脂肪生成的基因减弱。免疫荧光(n=4)和流式细胞(n=1)均发现IALVC组织存在心外膜祖细胞标记物和脂肪转录因子共存的“过渡态细胞”。结论：PG蛋白核异位抑制Wnt/β-catenin通路选择性调控位于左室表面心外膜祖细胞发育异常向脂肪细胞转化,由外膜向内膜逐渐取代左室心肌,参与孤立性心律失常性左室心肌病左室脂肪纤维化的发生。背景：传统的冠状动脉造影技术作为冠状动脉粥样硬化性心脏病诊断的“金标准”,但其真正的诊断能力和准确性尚不明确。目的：全面系统地评价冠脉造影诊断冠状动脉狭窄的准确性。方法：从2004年7月到2011年11月,阜外心血管病医院的病例中挑选因终末期心力衰竭行心脏移植术,并于术前因存在冠脉症状行冠脉造影术的患者97例。以冠状动脉病理解剖为“金标准”,“头对头”地比较冠脉造影与冠脉解剖之间的差异。结果：本组病人通过对心脏冠脉解剖检查发现45.4%的患者存在冠心病。以病人为基础(patient-based evaluation)的冠脉造影诊断精确性评价发现其诊断冠脉狭窄>50%的受试者曲线(ROC)下面积为0.91,敏感性为91%,特异性为93%, PPV91%, NPV93%：以血管分支为基础(Vessels-based evaluation)的冠脉造影诊断精确性评价291支分支血管发现其ROC曲线下面积为0.79,冠脉造影对单支血管(左主干-左前降支,左回旋支和右冠状动脉)狭窄大于50%的AUC面积分别为0.83,0.82,0.83；敏感性分别为0.9,0.74,0.75；特异性分别为0.89,0.91,0.90；阳性预测值分别为0.85,0.76,0.78；阴性预测值分别为0.93,0.90,0.88；将血管段分为近、中和远三段以血管段为基础(Segment-based evaluation)评价冠脉造影的准确性发现近中段ROC曲线下面积为0.88,而远段冠脉造影曲线下面积仅为0.62。以病人和血管分支为基础评价冠脉造影诊断狭窄>75%的诊断精确性与其诊断冠脉狭窄>50%的诊断能力类似。以血管段为基础(Segment-based evaluation)分析发现,无论在诊断冠脉狭窄>50%或者75%,血管近段的诊断精确性明显高于远段,而且患者冠脉病变越复杂,越严重,其诊断能力越差。采用Syntax评分评估冠脉造影对复杂冠脉病变的诊断能力发现其对高分组(Syntax评分>33分)患者诊断能力较差,但对中,低分组(Syntax评分<33分)诊断能力改善。结论：冠脉造影在以病人为基础和以血管分支为基础的诊断冠心病准确度较高,然而在对越复杂病变和越严重病变诊断能力下降,特别是对远段血管段的诊断能力下降,需要进一步提高。