蒙古冰草抗旱相关基因MwCP和MwAP2/EREBP的克隆及功能分析

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干旱是影响植物生长的重要非生物胁迫因子,严重影响小麦等作物的产量、质量和种植范围。随着基因工程的开展和转基因技术的不断成熟,克隆植物抗旱相关基因并利用转基因技术改良作物抗逆性,具有良好的前景。  半胱氨酸蛋白酶基因和AP2/EREBP转录因子均是植物体内可以响应干旱胁迫而表达的基因,其表达产物可以降低干旱胁迫对植物造成的伤害。  本研究以蒙古冰草为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆了蒙古冰草半胱氨酸蛋白酶基因MwCP和AP2/EREBP转录因子基因MwAP2/EREBP,分析了两者在干旱胁迫下的时间特异性和器官特异性表达模式,并将该两个基因导入拟南芥中,初步分析了两个基因的抗旱功能。  本研究主要得到以下结果:  1.利用RACE技术,从蒙古冰草中分离出了一个半胱氨酸蛋白酶基因,并命名为MwCP,Genbank注册号为KP899098。该基因全长1473bp,含有1个1134bp的开放型阅读框,编码377个氨基酸,N端有24个氨基酸组成的信号肽,属于木瓜蛋白酶C1A家族成员。该基因编码蛋白属于亲水性稳定的分泌性蛋白,二级结构主要是α螺旋结构和无规则卷曲,三级结构主要有α螺旋和β折叠、β转角。该基因编码的氨基酸序列与Genebank中小麦CP蛋白(登录号:AAW21813.1)具有98%的同源性。RT-PCR结果表明,MwCP基因受干旱胁迫的诱导而表达,随着胁迫时间的增长,呈现先增加后减少的趋势,且该基因的表达具有时间特异性和器官特异性。  2.构建了MwCP基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化法获得了转MwCP基因的拟南芥植株。通过对转基因植株进行复水试验及抗旱生理指标测定,初步验证了该基因的抗旱功能。结果显示,干旱胁迫复水后,转MwCP基因拟南芥的存活率是对照的1.72倍;干旱胁迫后,转MwCP基因拟南芥的游离脯氨酸含量、叶绿素含量、超氧化物岐化酶活性的增加量均高于野生型拟南芥,丙二醛含量增加量低于野生型拟南芥。除超氧化物岐化酶活性外,其他三个指标两者差异显著。复水试验及游离脯氨酸含量、叶绿素含量、丙二醛含量和超氧化物岐化酶活性4个生理指标的综合测定结果表明,导入外源MwCP基因可增强拟南芥抵御干旱胁迫的能力。  3.利用RT-PCR和RACE技术,从蒙古冰草中克隆了一个AP2/EREBP类转录因子的全长cDNA,命名为MwAP2/EREBP,Genbank注册号为KJ534637。序列分析表明MwAP2/EREBP基因全长1199bp,含有1个813bp的开放型阅读框,编码270个氨基酸,含有一个由64个氨基酸残基组成的AP2保守区,属于AP2/EREBP类转录因子家族。该基因编码蛋白属于亲水性蛋白,状态不稳定,定位在细胞核内。编码蛋白二级结构的主要组成部分为无规则卷曲和α螺旋结构,三级结构包含1个α螺旋和3个β折叠。该基因核酸序列与多枝赖草同源转录因子基因(登录号:AFO12475.1)亲缘关系最近。利用半定量RT-PCR技术分析MwAP2/EREBP基因的表达结果表明,该基因的表达受干旱胁迫的诱导,且该基因的表达具有时间特异性和器官特异性。  4.构建了MwAP2/EREBP基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化法获得了转MwAP2/EREBP基因的拟南芥植株。通过对转基因植株进行复水试验及抗旱生理指标测定,初步验证了该基因的抗旱功能。结果显示,干旱胁迫复水后,转MwAP2/EREBP基因拟南芥的存活率是对照的1.33倍;干旱胁迫后,转MwAP2/EREBP基因拟南芥的游离脯氨酸含量、叶绿素含量、超氧化物岐化酶活性的增加量均高于野生型拟南芥,丙二醛含量增加量低于野生型拟南芥。四个指标中,两者仅脯氨酸含量差异显著。根据复水试验及四个生理指标的综合测定结果,我们推测导入外源MwAP2/EREBP基因对于拟南芥抵御干旱胁迫的伤害具有一定作用。
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