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本课题的一部分工作是探讨SARS-CoVN蛋白可能的生物学功能,具体研究如下:1)构建带myc标签和HA标签的N蛋白真核表达载体,利用免疫荧光染色和N蛋白的pEGFP表达载体检测初步确定N蛋白定位在细胞浆。2)通过免疫沉淀发现293细胞内一分子量大约90KDa的未知蛋白与N蛋白有相互作用。3)通过免疫共沉淀发现SARS-CoVN蛋白与其RNA聚合酶有相互作用,且推测一个聚合酶分子有可能和多个N蛋白分子作用。4)利用N蛋白磷酸化抗体检测发现N蛋白存在丝氨酸位点的磷酸化修饰,并初步证实N蛋白可以抑制ERK/MAPK通路和PI3K/Akt通路及激活凋亡信号分子。5)最后,我们用N蛋白特异性抗体验证了该实验所用真核载体表达的N蛋白是特异的SARS-CoV核衣壳蛋白,证明了上述实验结果是有意义的。该课题旨在寻找N蛋白与病毒致病性的关系以及SARS病毒的致病机理,对有效地预防、诊断和治疗SARS具有重要的意义。
RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA(dsRNA)诱发的序列特异性转录后基因沉默。由于RNAi技术具有高效、专一、用量少、毒性小的特点,因此近年来已经作为一种抑制基因表达的工具被广泛的应用。
本课题的另一部分工作是设计并构建了针对SARS-CoVN蛋白的特异性siRNA表达质粒,并在细胞水平上证实了siRNA对N蛋白的表达存在干扰效应及干扰的剂量效应。该工作为SARS冠状病毒N蛋白的功能研究奠定了基础,为研究N蛋白和SARS-CoV致病性的关系提供了新的平台,为预防、治疗SARS提供了新的思路和方法。