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土壤次生盐渍化是限制设施蔬菜发展的主要因素之一,严重影响蔬菜的产量和品质。研究表明,设施土壤中阴离子类型主要为NO3-。NO是重要的细胞信号分子,在植物生长发育和胁迫应答过程中起着重要的作用。一方面,NO能直接或间接激发多种氧化还原调节（防御相关）基因表达。另一方面,在胁迫中NO主要通过S-亚硝化和硝化对靶蛋白进行翻译后修饰来调控其活性。抗坏血酸-谷胱甘肽循环（ASA-GSH）中抗坏血酸过氧化物酶（APX）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）和谷胱甘肽还原酶（GR）参与活性氧的清除。这些酶的活性通过NO介导的S-亚硝基化、硝化进行调节。本文主要对番茄ASA-GSH循环关键酶（APX、MDHAR、GR）参与NO缓解硝酸盐机理进行研究,取得结果如下:1.研究了外源施加NO（供体硝普纳,SNP）对ASA-GSH循环关键酶的影响。与正常培养的番茄幼苗相比,100 m M硝酸盐胁迫条件下,番茄幼苗的H2O2和丙二醛（MDA）含量明显增加,而施加外源SNP后其含量明显降低。与对照（CK）相比,硝酸盐胁迫下,番茄幼苗叶、根中的APX、GR、MDHAR基因的表达量和酶活性均显著增加,根和叶中MDHAR蛋白和根中GR蛋白表达也增加。添加外源NO后,与硝酸盐相比,叶中APX的基因表达和酶活性降低,根中APX基因、酶活性增加;叶中GR活性降低,根中GR活性变化很小;叶、根中MDHAR活性均降低,而叶中MDHAR在处理3 h、6 h、1 d的活性均比CK还要低。此外,与CK相比,硝酸盐胁迫下,番茄幼苗叶、根中的SOD、POD酶活性均增加,叶中的CAT活性降低,而根中的CAT活性增加;与硝酸盐相比,硝酸盐和SNP处理后,番茄叶、根系中SOD活性降低,番茄幼苗叶中3 d、5 d的POD活性增加,根系中的POD活性也增加,根中3 h、6 h、1 d的CAT增加,叶中6 h、1 d、3 d、5 d的CAT活性也增加。与CK相比,硝酸盐胁迫下,叶中的DHAR活性降低,根中DHAR活性增加。与硝酸盐胁迫相比,硝酸盐和SNP处理1d后,叶中DHAR活性增加,而根系中的DHAR活性均比CK和硝酸盐胁迫的低。以上结果说明ASA-GSH循环关键酶APX,MDHAR和GR参与NO缓解硝酸盐胁迫的过程。2.研究了硝酸盐胁迫和NO处理后番茄叶和根中的S-亚硝基化水平并鉴定S-亚硝基化靶蛋白。结果表明,硝酸盐处理后,叶和根中的S-亚硝基化水平增加。通过生物素转化并结合MALDI-TOF-TOF的方法,发现根中发生亚硝基化的蛋白包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1、乌头酸水合酶、蔗糖合酶、腺苷高半胱氨酸酶、S-腺苷甲硫氨酸合酶1、磷酸甘油酸激酶、膜联蛋白、肽基脯氨酰顺反异构酶、延伸因子1-α、未知蛋白,叶中发生亚硝基化的蛋白包括二磷酸核酮糖羧化酶长链、放氧增强子蛋白1、未知蛋白。在分离的S-亚硝基化蛋白中,通过western blot检测到ASA-GSH关键酶MDHAR发生了亚硝基化。通过GPS-SNO 1.0软件分析MDHAR中Cys27、Cys181、Cys379很可能是发生S-亚硝基化的位点。3.通过原核表达并纯化番茄APX蛋白,分析S-亚硝基化和硝化作用对其活性的影响。结果表明,S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）（调控蛋白S-亚硝基化）增加了APX酶活性,而过氧亚硝基阴离子（ONOO-）（调控蛋白硝化）抑制了APX活性。通过GPS-SNO 1.0和GPS-YNO2 1.0分别对番茄APX S-亚硝化和硝化位点进行预测,表明Cys4可能为S-亚硝基位点,Tyr5、Tyr12和Tyr235可能是硝化位点。4.克隆番茄抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、单脱氢抗坏血酸还原酶基因全长的c DNA序列,并构建了植物过表达载体p RI101-Sl APX、p RI101-Sl GR、p RI101-Sl MDHAR,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,对转基因烟草进行基因组PCR、q RT-PCR、western blot分析表明,获得了过表达Sl APX、Sl GR、Sl MDHAR基因的转基因烟草。