第一部分肠道菌群变化与异基因造血干细胞移植患者发生急性移植物抗宿主病的关系的临床研究目的:观察异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)患者肠道菌群的变化情况,分析其与急性移植物抗宿主病(a GVHD),尤其是肠道a GVHD发生之间的关系。方法:共有47例在苏州大学附属第一医院血液科接受allo-HSCT的血液系统疾病的患者入组。其中男性29例,女性18例,中位年龄36岁。16例行亲缘间全相合造血干细胞移植(MSD-HSCT),15例行无关供体异基因造血干细胞移植(MUDHSCT),16例行亲缘半相合异基因造血干细胞移植(HRD-HSCT)。患者在接受移植过程中,分别选择预处理化疗前、骨髓空虚期和造血重建后3个时间点,留取患者的粪便标本。抽提细菌基因组DNA后,聚合酶链式反应(PCR)扩增其16S r RNA V3可变区,进行454焦磷酸测序。利用所得到的数据进行生物信息学分析。观察alloHSCT患者在移植过程中其肠道菌群结构组成的变化情况,及其与a GVHD之间的关系。结果:47例患者在接受allo-HSCT后造血重建,且均获得持续稳定的供体植入。其中16(34%)例患者未发生a GVHD,31(66%)例患者发生a GVHD,在发生a GVHD的31例患者中,I-II度a GVHD的有19(61%)例,III-IV度a GVHD的有12(39%)例。a GVHD累及部位包括皮肤、肝脏及肠道,其中累及皮肤和/或肝脏的患者有12(39%)例,而累及肠道(合并或不合并皮肤、肝脏受累)的患者有19(61%)例。通过对141份样本的测序结果的分析,发现在门(phylum)的水平,患者肠道菌群中丰度最高的包括厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)等,在预处理化疗前、骨髓空虚期、造血重建后,以上各门的丰度在患者个体中随着移植的进行均发生了变化。对未发生a GVHD的患者与发生a GVHD的患者进行了比较分析,结果显示,在造血重建后,肠道菌群整体结构存在较大的差异。属(genus)水平,在未发生a GVHD的患者中,Bacteroides和Escherichia-Shigella有着比发生a GVHD的患者更高的含量(P<0.05),而Enterococcus含量则比发生a GVHD的患者要低(P<0.05)。此外,肠道a GVHD患者的肠道菌群变化较肠道未受累的a GVHD患者更为突出。结论:allo-HSCT患者在移植过程中,肠道菌群结构发生了动态变化。而某些肠道菌群的组成结构改变与a GVHD,尤其是肠道a GVHD密切相关。第二部分粪菌移植治疗激素耐药的肠道急性移植物抗宿主病的临床研究目的:观察粪菌移植(FMT)在激素耐药的肠道a GVHD患者中临床应用的安全性及有效性。方法:8例在苏州大学附属第一医院血液科接受allo-HSCT后出现激素耐药的肠道a GVHD的患者入组。其中男性3例,女性5例,中位年龄35.6岁。2例行MSDHSCT,1例行MUD-HSCT,5例行HRD-HSCT。患者均被评估为激素耐药的肠道a GVHD,加用一种或一种以上的二线药物治疗,疗效欠佳,遂给予FMT治疗。(1)观察FMT治疗激素耐药的肠道a GVHD的安全性和有效性。(2)收集了2例粪菌供体和6例患者(FMT前、FMT后1周)的粪便标本,以16S r RNA高通量测序的方法对其肠道菌群组成的变化情况进行初步的研究和分析。结果:(1)入组的8例激素耐药的肠道a GVHD患者均无艰难梭状芽胞杆菌感染(CDI),肠道a GVHD的发病中位时间是移植后+79.7天。患者诊断为a GVHD后,均接受了标准的一线抗a GVHD治疗,被评估为激素耐药的a GVHD后,加用一种或一种以上的二线药物治疗,疗效仍然不佳。FMT前,患者的中位腹泻量是1,777ml/天,中位腹泻频率是11.5次/天,有4例患者存在明显的腹痛。(2)8例患者中各有4例分别接受了1次或2次的FMT。在FMT后有3例稍有恶心、呕吐症状,2例有轻微腹胀,1例患者在FMT后30天内出现巨细胞病毒(CMV)激活。所有患者在第1次FMT后,均获得了临床症状的缓解,腹泻量下降、腹泻次数减少;存在腹痛表现的4例患者中,3例均逐步缓解。有4例患者在FMT后4周内腹泻症状消失,90天的随访时仍然存活;2例患者在治疗过程中出现反复,最终因严重并发症而死亡;1例病人死于由于血小板减少而导致的颅内出血;1例患者因为经济原因,放弃治疗并最终死亡。(3)激素耐药的肠道a GVHD患者在接受FMT前的肠道菌群的多样性明显低于粪菌健康供者(P<0.01),在FMT后1周肠道菌群的多样性较FMT前有了明显的恢复(P<0.01),但仍然低于健康供者(P<0.01)。研究中发现,在激素耐药的肠道a GVHD患者,其肠道菌群中Firmicutes与Proteobacteria的比例失衡,且Bacteroidetes的含量明显减少。在FMT后1周,肠道菌群的组成结构得到重建,有逐步恢复的趋势。结论:FMT可能通过改善肠道菌群的多样性和结构组成,成为治疗激素耐药的肠道a GVHD的一种安全、有效的方法,但还需要扩大病例数来进一步评估。第三部分益生菌在小鼠急性移植物抗宿主病模型中的作用的初步探讨目的:选取目前应用较多的鼠李糖杆菌(LGG)菌株和实验室筛选、分离出的一株嗜酸乳杆菌Pro15菌株作为观察对象,研究了它们在小鼠a GVHD模型中,对a GVHD的发生、发展及a GVHD相关生存的影响,并初步探讨了其作用机制。方法:(1)将雌性BALB/c小鼠(受体鼠)分为PBS组、LGG组和Pro15组,在移植前-7、-5、-3和-1天分别给上述3组小鼠灌服PBS、用PBS重悬的LGG菌株及Pro15菌株,并对受体鼠行全身致死性照射(7.5Gy)后,输注雄性C57BL/6(H-2b)小鼠(供体鼠)骨髓细胞(1×107)+脾脏细胞(5×106)以建立小鼠清髓性allo-HSCT后a GVHD模型。(2)移植后每2天对各组移植小鼠的体重及a GVHD表现进行评估,每天观察小鼠的生存情况。(3)移植后第4天收集小鼠的肺、肝脏、肠道(小肠和结肠),通过HE染色进行病理组织学检查。(4)流式检测移植后第4天小鼠脾脏、肺、肝脏、肠系膜淋巴结的T细胞的数量和功能变化情况。(5)细胞因子微球检测技术(CBA)检测植后第4天时血浆中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-10和IL-17A的水平。(6)制备了LGG、Pro15的热灭活菌株及培养上清,并在移植前分别对BALB/c小鼠进行灌胃,建立C57BL/6(H-2b)供BALB/c(H-2d)小鼠的清髓性异基因骨髓移植a GVHD模型,观察各组小鼠的生存情况。(7)于移植后第4天,首先利用异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-dextran)示踪法对PBS组、LGG组和Pro15组小鼠的肠道通透性进行了检测;其次,利用鲎试剂偶氮显色法检测PBS组、LGG组和Pro15组小鼠血清中细菌脂多糖(LPS)的水平;最后,检测了移植后第4天,各组小鼠肠上皮细胞表达TLR2和TLR4的情况。(8)通过对各组移植小鼠的粪便细菌进行16S r RNA高通量测序,动态观察了各组小鼠在移植前后(移植-1天、移植+2天、移植+5天)肠道菌群的多样性及结构组成的变化:以shannon指数考察了肠道菌群多样性的变化;比较了PBS组和Pro15组小时肠道菌群组成成分的差异。结果:(1)LGG组和Pro15组小鼠发生a GVHD的严重程度均轻于PBS组小鼠;两组小鼠的存活时间也明显优于PBS组小鼠,Pro15组的情况最好。(2)Pro15组小鼠肝脏、肺、肠道的炎症反应最轻。(3)Pro15组小鼠脾脏和肺脏的活化CD4+T细胞的比例较PBS组有明显的下降(P<0.01);活化CD8+T细胞在脾脏、肺脏和肠系膜淋巴结的比例,Pro15组小鼠也明显低于PBS组(P<0.01);LGG组小鼠脾脏中的CD4+IFNγ+T细胞和CD8+IFNγ+T细胞的比例均明显低于PBS组(P<0.05);与PBS组相比,LGG组和Pro15组在肝脏和肺脏的CD8+IFNγ+T细胞的比例都有一定程度的下降趋势,但是没有显著差异。(4)LGG组和Pro15组小鼠血浆中IFN-γ水平较PBS组有下降,但没有显著性差异。(5)无论是灌服LGG、Pro15的热灭活菌株,还是灌服这两种菌株的培养上清,与对照组小鼠相比,均不能改善异基因移植后a GVHD小鼠的生存。(6)Pro15组小鼠血浆中FITC-dextran水平明显低于PBS组小鼠(P<0.05);灌服LGG菌株和Pro15菌株的小鼠血清中LPS的含量均低于灌服PBS的小鼠,其中Pro15组小鼠血清中内毒素含量显著低于PBS组小鼠(P<0.001);Pro15组小鼠的小肠细胞中,TLR4的表达明显低于PBS组小鼠(P<0.05)。(7)移植-1天及移植后第2天,各组小鼠肠道菌群多样性无显著差异;移植后第5天,Pro15组小鼠的Shannon指数明显高于PBS组小鼠(P<0.05),体现出更好的菌群多样性。(8)在移植后第5天,PBS组和Pro15组小鼠间,肠道菌群的组成成分存在着明显的差异。结论:Pro15菌株能够减轻allo-HSCT小鼠的a GVHD发生的严重程度,延长小鼠的生存。Pro15菌株能够更好的保护小鼠肠道的屏障功能,阻遏了TLR4/LPS通路;Pro15菌株能使得小鼠肠道菌群保留更高的生物多样性。