研究背景和目的:黏蛋白型O-糖基化是最为普遍的一种蛋白质糖基化,它的起始反应由多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcTs, EC2.4.1.4.1)催化,将UDP-GalNAc上的GalNAc基团转移至蛋白质多肽链上特定序列中的Thr或Ser的羟基上从而合成GalNAcα-O-Ser/Thr多肽。研究证明细胞中的O-糖链对许多细胞功能如生长发育具有重要的作用,抑制和切除细胞表面的糖链都会造成细胞的生长行为的改变,甚至凋亡、死亡;细胞表面的糖链结构也与肿瘤细胞黏附和迁移功能密切相关。ppGalNAc-T家族中每个成员的表达具有组织特异性和生长周期特异性,由于ppGalNAc-T2的广泛分布和光谱的底物专一性,推想其有较重要的生物学功能,可能为蛋白质翻译后加工过程中的限速酶,故本文以此酶作为重点研究对象。白血病是一类造血干细胞的克隆性恶性疾病,居35岁以下人群恶性肿瘤死亡率的首位,其发病率有逐年增高的趋势。虽然在过去几十年里白血病的治疗有了长足的进步,但治疗相关的毒副作用和耐药复发严重影响着患者的总体生存率。因此需要我们寻找新的药物去更好的优化治疗方案,减少治疗毒副作用和交叉耐药性,提高总体生存率。三氧化二砷(As2O3)是从我国中医药中发掘出来的治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)有肯定疗效的药物,被美国NCCN的AML诊疗指南列为疾病持续不缓解或复发时挽救治疗的首先用药,是中西医结合治疗成功的经典例证。钒是周期表VB家族成员之一,在自然界中广泛存在。在过去几十年里人们对钒的认识发生了巨大的变化,从开始认为钒是一种微毒且能致癌的元素到最后认为它是一种必需的微量元素且具有抗糖尿病和抗癌的特性。近年研究者不断深入了解钒的生物作用的化学机理,发现在药理生理浓度下,钒化合物可作为一种潜在的治疗试剂。近几年,设计和寻找有效低毒药物治疗白血病已经成为研究方向。三氧化二砷与偏钒酸钠联合是否具有协同作用?其内在的分子机制又是什么,是否与蛋白质O-糖基化的改变相关?针对上述问题,本实验着重探讨三氧化二砷、偏钒酸钠自身及两者联合诱导HL-60细胞(人急性髓系白血病细胞株)凋亡的作用,并采用各种分子生物学技术,研究其内在的分子机制。第一部分三氧化二砷、偏钒酸钠诱导HL-60细胞凋亡方法1.用MTT方法检测在不同浓度三氧化二砷或/和偏钒酸钠作用下HL-60细胞的增殖。2.用流式细胞仪检测不同浓度三氧化二砷或/和偏钒酸钠作用下HL-60细胞的凋亡。3.用Hoechst 33258及DNA ladder检测不同浓度三氧化二砷或/和偏钒酸钠作用下HL-60细胞的凋亡。结果1.MTT方法检测不同浓度的三氧化二砷均可抑制HL-60细胞的增殖,并随着药物浓度的增加对细胞的杀伤作用亦增加。2.MTT方法检测不同浓度的偏钒酸钠对HL-60细胞生长影响的总体趋势是,低剂量的偏钒酸钠促进细胞增殖,高剂量的偏钒酸钠抑制细胞的生长。3.MTT方法检测单独使用5μmol/L的三氧化二砷和10nmol/L的偏钒酸钠对HL-60细胞增殖的抑制作用要小于联合使用5μmol/L的三氧化二砷和10nmol/L的偏钒酸钠。4.流式结果显示不同浓度的三氧化二砷20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L、1μmol/L作用HL-60细胞24小时后,凋亡率分别是51.18%、24.88%、23.18%、19.19%;不同浓度的偏钒酸钠500nmol/L、100nmol/L、10nmol/L、1nmol/L、1×10-2nmol/L作用HL-60细胞24小时后,凋亡率分别是69.49%、55.18%、39.94%、31.87%、31.32%;5μmol/L的三氧化二砷和10nmol/L的偏钒酸钠联合作用HL-60细胞24小时后,凋亡率是50.04%。5.Hoechest33258染色,荧光显微镜检测到HL-60细胞经不同浓度的三氧化二砷或/和偏钒酸钠处理24h后,发现空白对照组HL-60细胞核完整,染色质分布均匀,染色浅淡;不同实验组细胞均出现核致密浓染,某些实验组可见染色质固缩及片段化断裂,甚至呈碎片状。6.HL-60细胞经不同浓度的三氧化二砷或/和偏钒酸钠处理24h后,在琼脂糖凝胶电泳中出现180-200bp或其整倍数的片段,形成明显的梯形条带。第二部分三氧化二砷、偏钒酸钠诱导HL-60细胞凋亡与ppGalNAcT2相关方法1.用生物信息的方法检测砷、钒是否可以与ppGalNAcT2发生作用。2.用RT-PCR方法检测不同浓度的三氧化二砷、偏钒酸钠作用下ppGalNAcT2在mRNA水平表达的变化。3.用免疫荧光和流式检测不同浓度的三氧化二砷、偏钒酸钠作用下PNA表达的变化。结果1.分别成功对接了VO3和ppGalNAcT2、As和ppGalNAcT2;VO3可以同不同状态下ppGalNAcT2的活性相关结构形成氢键,As只与ppGalNAcT2处于2FFU时的活性相关结构形成氢键;分子动力学模拟的结果证实VO3和As可能影响ppGalNAcT2蛋白柔性特别是环B柔性的变化。2.RT-PCR结果显示,加入不同浓度的三氧化二砷或/和偏钒酸钠的实验组与空白对照组相比,偏钒酸钠在加入极低浓度时ppGalNAcT2在mRNA水平的表达随药物浓度增加而略微升高,在药物高浓度时ppGalNAcT2在mRNA水平均降低。3.免疫荧光结果显示,花生凝集素PNA的表达随着三氧化二砷和偏钒酸钠浓度的增加而增加。4.流式结果显示,花生凝集素PNA的表达随着三氧化二砷和偏钒酸钠浓度的增加而表达增加,且只有在三氧化二砷和偏钒酸钠处于高浓度时,与空白对照组相比,花生凝集素PNA表达量的增加有统计学意义。第三部分ppGalNAc-T2基因正义、干扰表达载体转染HL-60细胞后对HL-60细胞生物学特性的影响方法1.将本实验室构建好的ppGalNAc-T2正义(pEGFP-C1-T2)、干扰表达载体(pSilenCircle-T2,Si-T2)转染HL-60细胞,同时设与ppGalNAc-T2正义、干扰表达载体对应的空载体对照组(pEGFP;pSilenCircle,Scr-T2),及空白对照组(未转染的HL-60细胞)。2.用RT-PCR方法检测不同载体转染HL-60细胞后,对ppGalNAcT2在mRNA水平表达的作用,确定转染结果。3.应用MTT检测转染不同载体对HL-60细胞增殖能力的影响。4.利用互联网选择与ppGalNAc-T2可能相关的肿瘤浸润转移相关功能基因—MMP2、TGFβ1,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测转染不同载体的HL-60细胞株MMP2、TGFβ1在mRNA及蛋白表达的变化。结果1.RT-PCR结果显示,转染ppGalNAc-T2正义(pEGFP-C1-T2)表达载体的实验组HL-60细胞中,ppGalNAc-T2在mRNA水平的表达明显高于两个对照组;转染干扰表达载体(Si-T2)的实验组HL-60细胞中,ppGalNAc-T2在mRNA水平的表达明显低于两个对照组。2.经不同ppGalNAc-T2载体处理48小时后,光镜下可见所有实验组细胞均出现增殖抑制,144小时后,光镜下可见转染ppGalNAc-T2正义表达载体的HL-60细胞仍然表现为增殖抑制,而转染ppGalNAc-T2干扰表达载体促进了HL-60细胞增殖。3.通过互联网选择与ppGalNAc-T2可能相关的肿瘤浸润转移相关功能基因—MMP2和TGFβ1;转染ppGalNAc-T2正义表达载体的HL-60细胞MMP2和TGFβ1在mRNA水平表达降低,转染ppGalNAc-T2干扰表达载体的HL-60细胞MMP2和TGFβ1在mRNA水平表达升高。4.MMP2和TGFβ1在转染ppGalNAc-T2正义表达载体的HL-60细胞中蛋白印迹降低,在转染ppGalNAc-T2干扰表达载体的HL-60细胞中蛋白印迹升高。第四部分偏钒酸钠/三氧化二砷对转染正义表达载体细胞株HL-60细胞的影响方法1.MTT检测偏钒酸钠/三氧化二砷对转染正义表达载体HL-60细胞株凋亡的影响。2.采用RT-PCR、Western blot方法检测在偏钒酸钠/三氧化二砷作用下转染正义表达载体HL-60细胞株肿瘤浸润转移相关功能基因MMP2、TGFβ1在mRNA及蛋白表达的变化。结果1.MTT结果显示偏钒酸钠/三氧化二砷具有协同促进转染正义表达载体HL-60细胞凋亡的作用。2.与空白对照组和转染ppGalNAc-T2正义表达载体的HL-60细胞相比,转染ppGalNAc-T2正义表达载体的HL-60细胞加药组(偏钒酸钠/三氧化二砷),对MMP2、TGFβ1 mRNA的抑制作用更加明显;利用Western blot方法检测结果与上述结果相同。结论本研究首次采用偏钒酸钠联合三氧化二砷治疗HL-60细胞;采用不同的方法检测偏钒酸钠和三氧化二砷诱导的HL-60细胞的凋亡是否与糖基转移酶ppGalNAc-T2相关;探讨了ppGalNAc-T2表达的变化对HL-60细胞增殖的影响;向转染ppGalNAc-T2正义表达载体的HL-60细胞中加人偏钒酸钠/三氧化二砷,观察三者联合作用的可行性。根据实验结果得出以下结论:1.三氧化二砷对HL-60白血病细胞株的增殖具有抑制作用,且呈时间和计量效应。2.偏钒酸钠可以抑制HL-60细胞的增殖,且偏钒酸钠对HL-60细胞生长影响的总体趋势是:低剂量的偏钒酸钠促进细胞增殖,高剂量的偏钒酸钠抑制细胞的生长。3.砷和钒可以与糖基转移酶ppGalNAc-T2的活性中心相关结构域形成氢键等相互作用,影响了ppGalNAc-T2催化相关柔性结构的构象变化而影响底物进入和离开酶的活性中心,因而抑制了酶的催化功能。4.转染ppGalNAc-T2正义表达载体可以抑制HL-60细胞的增殖,且转染ppGalNAc-T2正义表达载体的HL-60细胞株中MMP2和TGFβ1的表达水平降低。5.偏钒酸钠、三氧化二砷及转染ppGalNAc-T2正义表达载体,三者具有协同作用。