论文部分内容阅读
前期在湖羊羔皮毛囊中利用基因芯片技术筛选出不同花纹间差异表达基因BMP7,结合湖羊羔皮毛囊组织学特性关联分析,确定BMP7作为候选基因,BMP7蛋白是TGF-β超家族中最大的分泌型信号传导分子之一,BMP7除了与骨形成发生有关,还被发现与羽毛胚芽的大小和空间分布有关,在毛囊的发育与毛发生的生长中起着重要作用,但本身的调控机制并不清楚。为此,本研究对BMP7的转录调控机制进行初步研究,首先对湖羊不同组织进行BMP7表达水平分析,其次克隆BMP7近端启动子进行生物信息学分析,接着根据生物信息学分析结果与近端启动子序列构建系列缺失载体双荧光素活性检测,最后对转录因子结合位点定点突变和转录因子过表达验证,从而揭开BMP7启动子区的转录调控机制,为后续的研究提供依据。本研究主要通过以下几个方面研究BMP7的转录调控机制:(1)利用RT-qPCR对BMP7在湖羊的各个组织表达情况进行分析,发现在羔皮毛囊组织中高表达。(2)通过NCBI数据库得到BMP7转录起始点上游大约2000bp下游500bp的调控序列,以2500bp的序列为基础进行近端启动子克隆,获得了 1757bp的序列。对BMP7近端启动子上游转录调控区域进行了生物信息学预测分析,发现在BMP7近端启动子上游调控区存在-1216bp—-1166bp与-632bp—-582bp两个转录起始位点;对CpG岛分布情况分析,发现-549bp—+295bp处富含CpG岛,进行转录因子结合位点预测,发现有SP1、EGR1、NRF1、TFAP2B等转录因子结合位点。(3)根据BMP7近端启动子序列设计启动子系列缺失片段,将各个缺失片段构建到双荧光素酶报告基因载体上,转染293T细胞进行双荧光酶检测不同缺失片段活性并进行显著性比较,寻找双荧光素酶活性最高的序列片段,发现核心区域-758bp—-545bp之间活性较高,对其进行生物信息学预测,发现存在转录因子SP1、EGR1可能结合位点,对BMP7启动子转录调控起着一定作用。(4)为了进一步鉴定BMP7近端启动子上游转录调控区域的转录因子结合位点,根据生物信息学结果筛选出EGR1和SP1,对其转录因子结合位点进行定点突变,同时构建BMP7的转录因子EGR1进行过表达载体进一步验证。结果显示,突变后的BMP7近端启动子上游调控区的活性呈显著性降低;过表达EGR1转录因子,BMP7上游调控区活性呈显著性上升,初步推断EGR1与SP1对BMP7转录调控具有重要的作用。