研究背景结直肠癌（CRC）是一种常见的消化道恶性肿瘤,在全球范围恶性肿瘤中,其发病率及死亡率分别占据第三位与第四位;按照其发病部位可以分为结肠癌和直肠癌两种类别,但由于二者有较多共同的病理生理特征,因此临床上通常将其统称为结直肠癌并进行研究。自进入二十一世纪以来,结直肠癌的发病率和死亡率均显著升高,并且有年轻化的趋势,青年人CRC具有症状相对隐匿、缺乏特异性、恶性程度高、浸润转移较早等临床特点,结直肠癌已经对我国居民的生命健康造成了严重的影响,其防治已经是我们必须面对的重大社会课题。近年来,尤其是随着纤维结肠镜检查的开展,结直肠癌的早期诊断取得了一定的进步,这也大大改善了早期结直肠癌患者的生存率;但对于中晚期患者来说,其生存率并没有得到实质性改善,而导致患者死亡的主要原因是肝脏及肺部转移。因此进一步探究结直肠癌的致病及其转移机制,对改善结直肠癌患者的治疗及预后有重要的意义。Vogelstein经典学说认为:结直肠癌的发生是由外部因素与内部因素共同作用产生的结果,其发展过程涉及到多阶段及多因素。目前,世界各国的学者对于内部因素的研究焦点主要在遗传因素,比如结直肠癌易感基因的遗传。数据表明,CRC中有大约20%左右的发病与遗传相关,其中当前研究较为广泛的有两大类:遗传性结肠息肉病与遗传性非息肉病性结直肠癌;而外部因素主要指饮食因素,比如高脂肪、高蛋白、低纤维素膳食及亚硝酸盐类化合物的摄入等等。然而近年来,随着分子生物学,特别是基因测序技术的飞速发展,肿瘤研究由“病理时代”跨入“基因组学时代”,越来越多的国内外专家、学者开始意识到原癌基因的激活及（或）抑癌基因的失活,可能在肿瘤的发病过程中起到了至关重要的作用。原癌基因是人类或其他动物细胞固有的一类基因,是维持机体正常生命活动所必需的基因,由其编码的蛋白质产物几乎存在于体内各种细胞器;抑癌基因又称为肿瘤抑制基因,其可以指导合成具有抑制细胞增殖并阻止细胞癌变的蛋白质,正常情况下,二者均参与细胞的生长、分化、增殖及信号转导等正常功能,但在某些特定条件下,可造成细胞膜及胞内信号传导通路异常,最终使细胞呈现为异常分化,增殖失控和侵袭能力增强,从而促进了肿瘤的发生和进展过程。因此在结直肠癌发病的分子病因学层面,寻找其发生发展的原癌或抑癌基因,对于结直肠癌的防治具有关键的影响。SLP-2基因是耶鲁大学病理科在2000年发现的,其为Stomatin基因超家族的第二个被发现的成员,人SLP-2（hSLP-2）基因定位于9pl3.1,其组成有9个内含子与10个外显子,编码长约1500bp的mRNA,对由356个氨基酸编码的蛋白多肽链的合成进行指导。数据表明,SLP-2蛋白主要分布于细胞膜,参与组成细胞骨架,可通过调控细胞膜上多种离子通道而对细胞信号传导产生作用。此外,最新结论显示,细胞线粒体内也分布有SLP-2蛋白,可以调节线粒体膜相关蛋白的稳定性,并对ATP的合成产生一定影响。SLP-2蛋白在正常人体多种重要脏器及组织中都有所表达,其中在心脏、肝脏和胰腺中存在着明显的高表达。近年来,关于SLP-2在恶性肿瘤发生发展中的报道逐渐增多,并推测其可能为一新的癌基因。例如中国医学科学院张立勇等应用cDNA微阵技术对54例食管鳞癌患者进行了研究,结果发现与正常食管黏膜上皮相比,食管鳞癌组织中的SLP-2蛋白表达增长超过6倍;而在干扰SLP-2表达后,出现细胞分化趋于停滞,生长及增殖均受抑制等现象,提示其在肿瘤发展过程中可能起重要作用。同样在乳腺癌的研究中发现,腋窝淋巴结转移、全身远处转移及乳腺癌分期等与SLP-2蛋白高表达存在显著相关,而且患者术后总生存期与SLP-2的高表达呈负相关,这点在HER/neu阴性而淋巴结阳性的患者中表现更为明显,所以SLP-2蛋白可被作为标志物应用到乳腺癌患者的诊断与预后评估中。而在宫颈癌患者的研究中却发现SLP-2在癌组织中呈低表达,且其表达与患者的临床分期、有无淋巴结转移、肿瘤浸润深度、肿瘤大小无相关性,而只与组织分化程度相关。总之目前已有的研究表明,SLP-2可能与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关,但其与结直肠癌的关系,我们不甚清楚,因此对其在结直肠癌中的功能进行深入研究有重要的临床意义。本课题主要进行了以下3个方面的实验:第一:应用实时定量PCR及Western blot检测30例新鲜结直肠癌及癌旁正常组织标本中SLP-2mRNA及蛋白表达水平;应用免疫组化方法检测SLP-2在50例结直肠癌组织切片中的表达情况,并结合临床病理资料分析其临床意义,探讨SLP-2的表达与结直肠癌临床病理分期、预后等的关系。第二:首先通过检测5种实验室常用且具有代表性的结直肠癌细胞系中SLP-2的表达水平,筛选出本实验用细胞系;选取内源性表达较高的细胞系进行RNA干扰实验,内源性表达量较低的细胞系进行DNA质粒重组过表达实验,以构建SLP-2低表达及过表达细胞系,分别采取Transwell实验、MTT及细胞克隆实验等方式检测细胞体外迁移、侵袭及增殖能力的变化,以进一步研究SLP-2在结直肠癌中的生物学功能。第三:应用免疫组化方法检测上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transitions,EMT）相关标志蛋白在50例结直肠癌组织切片中的表达情况;应用qRT-PCR、Western blot等检测过表达或敲减SLP-2后结直肠癌细胞上EMT相关细胞标志物的表达变化,以探寻SLP-2促进结肠癌增殖及侵袭的相关机制及信号途径,最后通过已稳定转染高表达SLP-2的结直肠癌细胞株,建立裸鼠异种移植瘤模型和远处转移瘤模型,观察肿瘤动物体内生长及转移情况,以进一步验证体外细胞实验结果。第一部分SLP-2在结直肠癌中组织中的表达及临床意义研究目的检测SLP-2在结直肠癌及其癌旁正常组织中的表达水平,分析其表达与患者临床病理参数相互间的关系及其预后价值。研究方法收集30例于2015年1月至6月在德州市人民医院行根治性手术的结直肠癌患者,术后及时获取部分肠癌组织及对应癌旁正常新鲜组织,通过qRT-PCR及Western blot检测肠癌组织及癌旁正常组织中的SLP-2的mRNA及蛋白表达水平;另随机选取2010年到2011年行根治性手术的结直肠癌患者50例,通3过免疫组织化学方法检测SLP-2的表达情况,并根据染色结果将患者分为高表达组及低表达组,运用Chi-Square test分析SLP-2与各临床病理参数的关系,生存分析采用Kaplan-Meier法,运用Cox回归模型的单因素及多因素分析方法评估各个临床指标的预后价值。研究结果1..RT-qPCR结果显示:在30例CRC患者手术切除新鲜组织及对应癌旁组织中,有26例患者CRC组织中SLP-2的mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织,Western blot结果表明,有27例患者原发灶中SLP-2的蛋白水平明显高于癌旁组织,二者检测结果基本一致。2.免疫组织化学染色结果表明,在50例CRC患者手术切除的石蜡组织切片中,SLP-2主要表达于细胞膜及胞浆,这与目前的研究报道基本一致,其在肿瘤组织中的表达相对于癌旁正常组织是明显升高的（P<0.05）。3.相关性分析结果表明SLP-2与结直肠癌的组织分化程度、淋巴结转移及肿瘤TNM分期显著性相关（P<0.05）,而与病人年龄、性别、肿瘤大小无明显相关性（P>0.05）。Kaplan-Meier生存曲线显示SLP-2高表达的患者总生存时间明显低于SLP-2低表达患者（P<0.05）。多因素分析表明,CRC中SLP-2的蛋白表达水平可作为独立预后因素,预测患者总生存及无病生存状况。结论SLP-2的表达水平在结肠癌组织中明显高于癌旁正常组织,且其表达与结直肠癌的组织分化程度、淋巴结转移、肿瘤TNM分期及患者预后显著相关,推测其在结直肠癌的发生、演变中发挥重要的作用,具有成为结直肠癌患者早期诊断和治疗的潜在靶点的临床价值。第二部分SLP-2对结直肠癌细胞生物学行为的影响目的本部分研究首先通过检测5种常见的结直肠癌细胞株中SLP-2的表达水平,以选取实验用细胞株;再通过转染RNA干扰序列及重组质粒来调控细胞中SLP-2的表达,以判断其对结直肠癌细胞增殖及迁移能力的影响。方法1.选取常见5种结直肠癌细胞系（SW620、SW480、LoVo、HCT116、HT29）及正常结直肠粘膜上皮细胞FHC,用qRT-PCR及Western Blot的方法提取mRNA及总蛋白,检测SLP-2的表达水平;筛选出高表达及低表达SLP-2的细胞系用于后续实验。2.构建pcDNA3.1-SLP-2高表达质粒及空白对照质粒（Vector）,转染SLP-2内源性低表达的SW480细胞株,以构建SLP-2高表达细胞系（pcDNA-SLP-2）;订购 SLP-2 特异性小干扰 RNA（SLP-2-siRNA）及对照组 siRNA（Negative control siRNA,NC-siRNA）,转染SLP-2内源性高表达的细胞株,以构建低表达细胞系（SLP-2-siRNA）;转染48h后用qRT-PCR的方法检测过表达和干扰SLP-2的效率。3.筛选构建成功且稳定转染的两种细胞株,分别应用MTT及细胞克隆实验检测细胞增殖能力,利用Transwell小室实验检测细胞体外迁移及侵袭能力。结果1.结直肠癌细胞系中SLP-2的mRNA及蛋白表达水平均明显高于FHC,但其在各型细胞株中的表达也不同,初步表明SLP-2表达水平与结直肠癌细胞的侵袭性密切相关。2.成功构建且稳定转染了 SLP-2高表达及干扰序列的结直肠癌细胞株,经qRT-PCR结果验证转染效率,显示pcDNA-SLP-2及si-SLP-2能够有效的促使结直肠癌细胞株SW480和HCT116分别高表达和低表达SLP-2。3.MTT实验及细胞克隆实验结果显示:过表达SLP-2能够促进结直肠癌细胞SW480的增殖;敲低SLP-2表达能够显著抑制结直肠癌细胞HCT116的增殖（P<0.05）;Transwell小室实验结果显示SLP-2过表达后结直肠癌细胞SW480的迁移和侵袭能力明显增高,干扰SLP-2表达后结直肠癌细胞HCT116的迁移和侵袭能力明显降低（P<0.05）。结论SLP-2在各型不同结直肠癌细胞株中表达不同,其能够明显促进结直肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。第三部分SLP-2诱导结直肠癌EMT及侵袭转移的分子机制目的探讨SLP-2与结直肠癌EMT的关系及其参与的信号通路。方法1.对转染后的SLP-2高表达及低表达细胞分别进行光学显微镜下观察,以初步判断其是否存在EMT细胞形态改变等表型变化。2.应用兔疫组化检测EMT上皮细胞标志物E-cadherin,间质细胞标志物vimentin在50例结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况,分析两种标志物与SLP-2基因表达的相关性,初步判断SLP-2与EMT标志蛋白的相关性。3.应用qRT-PCR、Western blot等技术,检测过表达或敲减SLP-2后结直肠癌细胞株EMT上皮标志物（E-cadherin,CK）;间质细胞标志物（vimentin,fibronectin）;转录因子标志物（snail,slug）及Wnt信号通路下游靶基因（β-catenin,c-myc,cyclin D1）的表达变化,以探寻SLP-2促进结直肠癌增殖及侵袭的相关机制及信号途径。4.应用稳定转染高表达SLP-2的结直肠癌细胞株及其空白对照,建立裸鼠异种移植瘤模型和远处转移瘤模型,观察肿瘤生长及转移情况,并通过qRT-PCR、免疫组织化学染色等方法检测移植瘤实验组瘤体的增殖情况以及转移瘤实验组瘤体组织中SLP-2、E-cadherin、和Vimentin等表达的改变,进一步验证体外实验已证实的SLP-2的功能。结果1.光学显微镜下观察发现:SLP-2高表达细胞系细胞由卵圆形上皮细胞形态变成梭形、成纤维细胞样的间质细胞样形态,发生EMT改变趋向;2.免疫组织化学检测结果表明,在50例CRC患者手术切除的石蜡组织切片中,EMT间质细胞标志物vimentin在肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁对应组织（P<0.05）,而上皮细胞标志物E-cadherin在肿瘤组织中的表达水平明显低于癌旁对应组织（P<0.05）,相关统计学分析SLP-2与vimentin表达成正相关;而与E-cadherin的表达成负相关,提示结直肠癌中SLP-2的表达与细胞EMT有关,可能通过结直肠癌细胞发生EMT而促进转移。3.实时定量qRT-PCR和Westem-blot检测结果显示,在SLP-2过表达细胞系SW480中,间质细胞标志物（vimentin,fibronectin）,转录因子标志物（snail,slug）均明显上调,而上皮细胞标志物（E-cadherin,CK）则明显下调;同时,Wnt信号通路下游3个靶基因（β-catenin,c-myc,cyclin D1）表达亦明显上调;而在SLP-2干扰细胞系HCT116中,检测结果恰恰相反。从而进一步提示SLP-2可通过诱导结直肠癌EMT而促进其侵袭转移,并且可能通过激活Wnt信号通路促进结直肠癌细胞发生EMT.4.成功建立裸鼠异种移植瘤及远处转移瘤模型;在移植瘤模型中发现:SLP-2过表达细胞组的移植瘤生长速度及瘤体重量均显著高于对照组,且瘤体组织中增殖相关标志物Ki67的表达也明显高于对照组;在转移瘤模型中发现:SLP-2过表达细胞组的瘤体组织中SLP-2表达量明显高于对照组,而且EMT上皮标志物E-cadherin的表达明显下调,而间质标志物vimentin的表达呈现明显的上调。结论1.SLP-2与结直肠癌EMT相关;2.SLP-2可能通过Wnt通路促进结直肠癌发生EMT。