基于微流控芯片细胞中过氧化氢的检测

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细胞的代谢过程中不断产生各种活性氧自由基(ROS),例如超氧阴离子自由基(O2-.)、羟自由基(·OH)、脂自由基(ROO·)、过氧化氢(H2O2)等。它们一方面能够介导生命活动的众多生理过程,另一方面也能够对组织细胞的化学结构发生破坏性修饰,损伤正常组织细胞的形态和功能。研究表明,细胞中产生的过氧化氢,在一般情况下常被过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶清除,如果得不到及时清除,它可透过细胞膜与膜外的Fe2+或Cu+等金属离子结合生成HO·,从而导致膜脂过氧化、碱基突变、DNA链的断裂和蛋白质的损伤。因此对过氧化氢进行高灵敏度、高选择性的分析与检测对于研究过氧化氢如何参与各种生命活动是极为必要的。由于细胞尺度小、细胞内过氧化氢含量低、产生与转化速度快,使得目前一些传统的观察与分析方法多是将各种活性氧作为一个整体,获得的结果多是基于静态、宏观的观察和整体平均而推导出来的。它们普遍存在取样体积大、质量检测限高、分析信号的获得时间长、仪器价格昂贵等方面的不足。因此,在细胞层面上定性及定量测定过氧化氢的含量对当今自由基生物学研究具有重要的学术意义和应用价值。微流控芯片分析(microfluidic chip analysis)具有快速、低耗,并且能将多种功能单元集成于一个芯片等特点,它向实现维持一个闭合系统迈进了一大步。由于它可以实现完全的自动化,减少污染,降低干扰和人为误差,因而成为近年来生物、化学、医学等领域研究的重要平台之一。本论文以微流控芯片电泳激光诱导荧光分析系统为技术依托,以实验室自行合成的荧光探针为基础,对细胞中的过氧化氢(H2O2)的检测进行了研究。论文共分三个部分。在第一章中,简要阐述了微流控芯片在细胞分析领域的研究的进展。主要对微流控芯片在细胞培养、细胞操纵、细胞溶膜、细胞组分的检测等方面的应用进行了简单的介绍及综述。在第二章中,我们选择实验室内部合成的荧光探针二(对甲苯磺酰基)-二氯荧光素作为荧光标记试剂,以微流控芯片电泳-激光诱导荧光法作为分析平台,建立了一种未见报道的过氧化氢的检测方法,并且成功的用于RAW264.7细胞提取液中过氧化氢的检测。本方法在55 s内完成了对PMA刺激的RAW264.7细胞提取液中过氧化氢的检测,测得的结果与文献报道相符。这项应用为测定其他生物样品中的过氧化氢提供了一种思路。在第三章中,我们基于第二章中已建立的分析体系,对单个RAW264.7细胞在微流控芯片上的进样、分离及过氧化氢的测定进行了探索试验,初步实现了微流控芯片上单个RAW264.7巨噬细胞中过氧化氢的测定。
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