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目的:观察NO缺乏型高血压大鼠,在高血压不同时期,第四脑室外侧隐窝室管膜细胞的形态学变化,室管膜细胞的分泌情况,以及该处室管膜细胞Nestin表达变化规律。
方法:选择健康雄性Wistar大鼠60只,体重230g～250g,随机分为五组:①对照组(n=20)注射生理盐水;②用药1周组(n=10)③用药2周组(n=10)④用药3周组(n=10)⑤用药4周组(n=10)
1 NO缺乏型高血压大鼠模型制备:用药组动物予以一氧化氮合酶抑制剂一左旋硝基精氨酸(L-NNA)15 mg/d,早九点、晚九点分两次腹腔注射,制备高血压动物模型。对照组动物给予0.9％氯化钠2ml/d,早九点、晚九点分两次腹腔注射。
2光镜标本制备:常规经心灌注、固定、取脑,冠状方向去除小脑以前部分,取包含第四脑室外侧隐窝的脑块,常规石蜡包埋,连续石蜡切片,片厚5um。常规HE染色、Nestin免疫组化染色、封片。显微镜观察、照相。
3电镜标本制备:麻醉、灌注同光镜标本制备,但灌注液为含2％多聚甲醛和2.5％戊二醛的混合磷酸缓冲液。取包含第四脑室外侧隐窝的脑块用PBS冲洗,梯度酒精脱水,叔丁醇置换,真空干燥、喷金,日立S-3500N观察、照相。透射电镜样品制备与扫描电镜样品制备相同,取包含第四脑室外侧隐窝的脑块,放入4％戊二醛固定,1％锇酸后固定,树脂包埋,切片,T-S7500透射电镜观察、照相。
4统计学处理:Nestin阳性细胞采用麦克奥迪数码医学图像分析系统(Motic Med6.0)测定灰度值。数据用均数加减标准差((-x)±s)表示。应用SNK-q检验,进行两两比较,以P＜0.05为有显著性差异。
结果:1大鼠在连续注射左旋硝基精氨酸(L-NNA)4周后动脉收缩压(SBP)由用药前的101.30±5.40mmHg增加到178.70±5.56mmHg,与用药前相比明显升高(P＜0.05,n=10),提示高血压动物模型制备成功。
2光镜观察结果:
2.1对照组:第四脑室外侧隐窝室管膜细胞多呈单层排列,胞体呈立方形或矮柱状,大小均匀,排列整齐,胞核呈圆形或椭圆形,分布较稀疏。室管膜下可见丰富的毛细血管。Nestin免疫阳性细胞呈棕黄色,在各时间点的对照组,1、2、3、4周的时灰度值测定分别为158.21±2.33、158.27±2.52、160.69±3.08和159.34±2.84,比较结果无显著性差异(P＞0.05)。
2.2模型组:用药1周组,室管膜细胞排列密集,胞体大小不均;Nestin免疫阳性细胞分布密集甚至有重叠现象,染色呈棕褐色,灰度值测定为117.38±2.80。用药2周组,室管膜细胞排列更加密集且呈波浪样凹凸不平,细胞核排列不整齐。贴近血管处的室管膜细胞分布稀疏且形态较扁。Nestin阳性细胞呈棕褐色,灰度值测定为119.42±2.39。在用药3周组与4周组,室管膜细胞排列稀疏,细胞形态变扁,细胞核呈梭形、深染,脑室面纤毛稀疏。Nestin免疫细胞染色棕黄,灰度值分别为153.95±2.98、161.99±2.14。结果显示,高血压组第四脑室外侧隐窝室管膜细胞Nestin免疫细胞染色随着血压的升高呈现先加深后变浅的趋势。用药1周组与对照组、用药3周组、用药4周组比较均有显著性差异(P＜0.05);且用药2周组与对照组、用药3周组、用药4周组比较也均有显著性差异(P＜0.05)。
3扫描电镜观察结果:
3.1对照组:第四脑室外侧隐窝入口与出口游离面结构有很大差别:入口处,室管膜细胞轮廓清晰,胞体呈多边形,游离面有丰富的纤毛和微绒毛,纤毛成丛,微绒毛呈短棒状,丰富的触液纤维网紧贴于室管膜上皮细胞表面。触液纤维有两种:一种纤细表面光滑有分支,另一种呈结节样较粗。室管膜细胞表面可见散在的大小不等的分泌颗粒。出口处可见“淤泥样”分泌物将纤毛粘附在一起。
3.2模型组:用药2周组在第四脑室外侧隐窝出口处,大块的“淤泥样”分泌物将丰富的纤毛粘附呈片状,纤毛和微绒毛全部被覆盖。“淤泥样”结构周边部较薄,中央部较厚,可见成簇的纤毛粘附于“淤泥样”结构之上。用药4周组“淤泥样”分泌物有增多的趋势,且室管膜细胞表面分布有大量大小不等的分泌颗粒,有的表面光滑,有的表面出现皱缩或破裂。另外可见形状不规则、表面光滑、体积较大的分泌物。
4透射电镜观察结果:
4.1对照组:室管膜细胞排列整齐,边界清楚,纤毛和微绒毛丰富,细胞间连接清晰可见。胞体内线粒体等细胞器分布均匀;当处于分泌状态时,线粒体集中在细胞的顶部。
4.2模型组:在用药2周组,室管膜细胞体积大小不等,形态各异,边界不清,胞核皱缩染色质粗大,细胞游离面纤毛较少,可见向细胞顶部突出的“淤泥样”分泌物。用药4周组,室管膜细胞分泌活动更加旺盛,细胞游离面可见多种形态不同的分泌物,有“淤泥样”分泌物,有膜包颗粒状的分泌物,还有形状不规则、体积较大的分泌物。
结论:①在透射电镜下观察到,第四脑室外侧隐窝室管膜面上特殊“淤泥样”分泌物,随血压升高数量增多。②第四脑室外侧隐窝的室管膜细胞,在高血压模型二周时细胞大小不等、排列密集;四周时细胞低平、排列稀疏。③第四脑室外侧隐窝处的Nestin免疫阳性细胞在高血压模型一周时表达最强,三周后减弱同对照组,提示该部位Nestin免疫阳性细胞对高血压刺激敏感,并能逐步恢复正常表达水平。