帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的神经系统退行性疾病,主要病理改变是中脑黑质多巴胺（dopamine,DA）能神经元的选择性丢失和残存的神经元内形成以α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）聚集为主的路易小体。α-Syn的错义突变是导致家族性PD的主要原因。PD病人的神经影像检查以及尸检病理报告均已证实在黑质内有大量铁的沉积。虽然PD中黑质铁选择性沉积的原因尚不清楚,但本实验室前期的研究发现在PD中,铁转运蛋白如二价金属离子转运体1（divalent metal transporter 1,DMT1）和铁转出蛋白ferroportin 1（FPN1）在黑质的表达异常是导致铁在黑质沉积的主要原因。而铁调节蛋白1（iron regulatory protein1,IRP1）可通过调控DMT1与FPN1的m RNA上未翻译区域的铁离子反应元件（iron regulatory elements,IRE）调节DMT1和FPN1蛋白变化。但是作为PD的两个主要致病因素,α-Syn和铁之间的关系研究甚少。因此,本课题旨在探讨DA能细胞内α-Syn的聚集和细胞铁沉积之间的关系,以期为它们参与PD的发病机制提供新的实验依据。目前研究发现,铁可以通过三种方式促进α-Syn的聚集,一是直接与α-Syn结合,诱导其构象改变,二是通过Fenton反应产生的羟自由基促进α-Syn的聚集,三是通过调节α-Syn的磷酸化,引起它的聚集。同时,α-Syn也被证实为一种铁还原酶,能够将细胞内的Fe3+还原成Fe²⁺,而且α-Syn的表达异常也可以调节细胞的铁水平,在过表达α-Syn的PC12细胞和大鼠原代中脑神经元上给予铁处理,细胞内的铁水平显著增高而且出现了铁包涵物从细胞质转移到细胞核的重新分布。但是α-Syn调节细胞铁水平的机制尚不明确。针对这一实验目的,本实验应用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测细胞的存活率,流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测细胞线粒体膜电位（mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm）和活性氧物质（reactive oxide species,ROS）的变化,共聚焦显微镜检测细胞铁摄取能力的变化以及免疫印迹检测蛋白水平变化等多种实验方法,观察野生型α-Syn（wild-type alpha-synuclein,WTα-Syn）和A53T突变型α-Syn（A53T alpha-synuclein,A53Tα-Syn）过表达对SH-SY5Y细胞摄铁功能的影响,进而观察了其对铁转运蛋白水平的影响,并初步探讨了其可能机制。实验结果如下:1.在SH-SY5Y细胞内分别过表达空载体、WTα-Syn和A53Tα-Syn 24 hrs后,检测细胞存活率。结果表明,与对照组相比,WTα-Syn和A53Tα-Syn高表达组的细胞存活率没有明显改变。2.在SH-SY5Y细胞中分别高表达空载体、WTα-Syn和A53Tα-Syn 24 hrs后,检测细胞的铁摄取能力的变化。结果表明,与对照组相比,WTα-Syn和A53Tα-Syn组的细胞的铁摄取能力增加,差别具有显著统计学意义（P<0.05）。3.在SH-SY5Y细胞中分别高表达空载体、WTα-Syn和A53Tα-Syn 24 hrs后,给予100μM的Fe²⁺孵育4 hrs,用流式细胞仪检测ΔΨm和ROS水平。结果表明,与对照组相比,高表达WTα-Syn组和A53Tα-Syn组细胞内的ΔΨm降低,分别降低了11.77%和11.52%,差别具有高度统计学意义（P<0.001）。而高表达WTα-Syn组和A53Tα-Syn组ROS的生成升高,与对照组相比,分别升高77.89%和76.20%,差别具有高度统计学意义（P<0.001）。4.在SH-SY5Y细胞中分别高表达空载体、WTα-Syn和A53Tα-Syn 24 hrs后,检测细胞内IRP1、DMT1和FPN1的蛋白表达的变化。结果显示,WTα-Syn和A53Tα-Syn高表达组的DMT1的蛋白表达显著增加,与对照组相比,分别增加了56.18%和61.80%,差别具有统计学意义（P<0.05）,而IRP1和FPN1的蛋白表达没有明显变化。5.在SH-SY5Y细胞中分别高表达空载体、WTα-Syn与A53Tα-Syn 24 hrs后,检测细胞内泛素化蛋白酶体水平的变化。结果表明,与对照组相比,高表达WTα-Syn和A53Tα-Syn组细胞内泛素化蛋白酶体水平明显降低,分别下降了69.37%和65.35%,差别具有高度统计学意义（P<0.001）。而在空载体、WTα-Syn与A53Tα-Syn高表达同时给予30μM的自噬溶酶体抑制剂氯喹处理24 hrs,与对照组对比,WTα-Syn与A53Tα-Syn高表达组的细胞泛素化蛋白酶体水平不再降低。6.在SH-SY5Y细胞中分别高表达空载体、WTα-Syn和A53Tα-Syn 24 hrs并给予30μM氯喹处理24 hrs,结果表明,WTα-Syn和A53Tα-Syn组细胞IRP1、DMT1和FPN1的蛋白表达均未发生改变。综上所述,在SH-SY5Y细胞中分别高表达WTα-Syn和A53Tα-Syn,可以使DMT1的蛋白表达增高,进而增强细胞的铁摄取能力,细胞内铁水平的增高能够导致线粒体功能障碍,表现为ΔΨm的降低,ROS生成的增高。然而,细胞内IRP1与FPN1的蛋白表达未发生改变。而细胞的泛素化蛋白酶体水平显著降低。因此,DMT1蛋白表达的改变并非由IRP1调控所介导的,可能与WTα-Syn和A53Tα-Syn高表达抑制了细胞的泛素化蛋白酶体水平有关。本研究阐明了PD的两个致病因素α-Syn和细胞内铁聚积之间的关系,α-Syn的高表达能够增强DA能细胞的摄铁功能,加重细胞的损伤,为进一步理解PD的发病机制提供新的依据。