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目的:心肌缺血再灌注损伤是急性心肌梗死患者死亡的重要原因。氧化应激损伤是再灌注损伤的重要发病机制之一。氧化应激损伤能造成心肌细胞死亡,降低再灌注治疗的获益。因此预防再灌注损伤,探讨中医药对再灌注损伤的保护作用,为缺血性心肌病的防治提供有效的理论、实验依据,具有重要的意义。既往研究提示,乌头赤石脂丸能够抑制急性心梗大鼠细胞凋亡,减轻再灌注损伤的作用,但其具体机制仍未被完全阐明。自噬是细胞的自我保护机制之一,现有证据表明,自噬在心肌缺血再灌注损伤中发挥“双刃剑”的作用,过度自噬导致心肌细胞凋亡、坏死,适度自噬可以起到延长心肌细胞活力,保护心肌功能的作用。自噬的调控涉及到多条信号通路,包括Erk1/2/Nrf2信号通路。Erk1/2/Nrf2信号通路激活后能诱导内源性细胞保护基因上调,包括抗氧化、抗炎相关蛋白。现有研究提示在氧化应激条件下,Erk1/2/Nrf2信号通路能够通过激活自噬,起到体内抗氧化物质协同消除ROS的作用。乌头赤石脂丸对急性心梗大鼠的心肌细胞具有保护作用,但其作用机制有待深入研究。自噬、线粒体损伤、氧化应激均是再灌注损伤的重要机制,且三者关系密切,因此自噬的安全性可以从线粒体损伤、氧化应激的相关指标进行判断。在此基础之上,采用多参数确认自噬性心肌细胞保护作用的前提下,从细胞活力、凋亡形态、凋亡相关蛋白表达情况,在体外水平阐述氧化应激条件下,乌头赤石脂丸通过增强自噬,减轻心肌细胞氧化应激损伤,探讨该药对Erk1/2/Nrf2/HO-1促生存信号通路作用、与自噬之间的联系和潜在作用,为临床应用“温阳”法治疗缺血性心脏病提供实验依据。研究内容:本实验利用H9C2心肌细胞系作为实验对象。(1)利用过氧化氢刺激H9C2构建氧化应激模型。(2)应用CCK-8法测定H9C2细胞活力,测定LDH释放、MDA生成量,SOD生成量,免疫荧光法观察细胞核染色质形态,Western blot法检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2,用自噬抑制剂Baf A1进行干预,观察乌头赤石脂丸含药血清对H9C2细胞的保护作用。(3)应用Erk1/2抑制剂考察乌头赤石脂丸通过Erk1/2/Nrf2/HO-1信号转导通路对自噬的调节作用。结果:(1)氧化应激模型的建立及乌头赤石脂丸对过氧化氢诱导H9C2心肌细胞的保护作用:CCK-8结果显示,过氧化氢EC50≈400μmol/L,因此采用400μmol/L过氧化氢诱导H9C2细胞4 h,构建氧化应激损伤细胞模型。与空白对照组相比,模型组细胞活力、SOD水平显著下降(P<0.01),LDH、MDA生成增加(P<0.05,P<0.01);阳性对照组、实验组细胞活力、SOD水平均显著高于模型组(P<0.05,P<0.01),LDH、MAD水平低于模型组(P<0.01);实验组细胞活力、SOD水平高于阳性对照组(P<0.05),该作用可以被自噬抑制剂Baf A1消除。免疫荧光结果显示,过氧化氢可以促进H9C2细胞凋亡,乌头赤石脂丸、参附汤均能抑制凋亡,细胞核完整规则;加入自噬抑制剂Baf A1后,模型组凋亡增加,细胞核破裂,凋亡细胞增多。Western blot结果显示:与空白对照组相比较,模型组的HO-1、Bcl-2表达量显著下降(P<0.01);Bax表达量显著上升(P<0.01)。与模型组相比较,实验组、阳性对照组的HO-1、Bcl-2表达量显著升高(P<0.01);Bax表达量显著下降(P<0.01)。与阳性对照组相比较,实验组的Bax、Bcl-2蛋白表达无显著差异,HO-1蛋白表达量显著升高(P<0.01),自噬抑制剂Baf A1能够消除该效应。与空白对照组比较,模型组LC3-Ⅱ表达水平显著下降(P<0.01)。与模型组比较,实验组、阳性对照组LC3-Ⅱ表达水平显著上升(P<0.01),应用自噬抑制剂,结果显示模型组自噬被抑制,实验组、阳性组促进自噬活化。(2)乌头赤石脂丸通过激活Erk1/2/Nrf2/HO-1信号通路,激活自噬,保护过氧化氢损伤的H9C2心肌细胞:CCK-8结果显示,与空白对照组相比,模型组细胞活力、SOD水平显著下降(P<0.01),LDH、MAD水平显著上升(P<0.01);阳性对照组、实验组细胞活力、SOD水平均显著高于模型组(P<0.05,P<0.01),LDH、MDA水平低于模型组(P<0.01);实验组细胞活力高于阳性对照组(P<0.05),该结果可以被GDC-0994消除。Western blot结果显示,与空白对照组相比较,模型组的Erk1/2磷酸化水平显著下降(P<0.01);Nrf2、HO-1、Bcl-2、LC3-Ⅱ表达量显著下降(P<0.01),Bax表达量显著上升(P<0.01)。与模型组相比较,实验组、阳性对照组的Erk1/2磷酸化水平显著升高(P<0.001);Nrf2、HO-1、Bcl-2、LC3-Ⅱ表达量显著升高(P<0.01),Bax表达量显著下降。与阳性对照组相比较,实验组的Erk1/2磷酸化水平显著升高(P<0.01),Nrf2、HO-1蛋白表达量显著升高(P<0.01)。各组之间的Erk1/2蛋白表达量无差异。Erk1/2抑制剂GDC-0994能抑制乌头赤石脂丸、参附汤诱导的Erk1/2磷酸化(P<0.01),消除乌头赤石脂丸对Nrf-2、HO-1、Bcl-2、LC3-Ⅱ的上调效应和对Bax的下调效应。结论:(1)氧化应激-自噬途径参与心肌缺血再灌注损伤,导致心肌细胞活力呈时间依赖性降低,并造成心肌细胞抗氧化酶被消耗,细胞凋亡相关蛋白表达上调,导致心肌细胞凋亡。(2)乌头赤石脂丸含药血清能保护过氧化氢导致的心肌细胞损伤,抑制Bax表达,促进Bcl-2、LC-3蛋白表达,促进SOD生成,减小LDH、MAD水平,促进细胞自噬。这一过程可以被自噬抑制剂Baf A1消除,表明自噬是保护心肌细胞防止氧化应激损伤的保护机制。(3)乌头赤石脂丸含药血清能够通过激活Erk1/2信号通路、促进Nrf-2、HO-1蛋白表达,促进LC3、Bcl-2蛋白表达,在抑制剂GDC-0994存在下,Nrf2、HO-1、LC3、Bcl-2表达下调,Bax表达上调,SOD水平下降,MDA、LDH水平上升。表明可能通过上调Erk1/2/Nrf2/HO-1信号通路促进心肌细胞自噬,发挥抗氧化应激作用。然而乌头赤石脂丸干预心肌细胞自噬存在多靶点和多通路特征,具体机制仍有待进一步研究。