梅花品种耐旱性差异分析及褪黑素合成基因功能研究

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梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)是我国的传统名花,具有较高的观赏价值。梅花天然分布于中国长江流域以南地区,周年需水量较大,但北方地区年降雨量少、年蒸发量大且干旱情况频发,干旱是限制梅花在北方地区推广栽培的重要环境因子之一,但梅花响应干旱胁迫的机制尚不清楚。本研究以梅花品种‘淡丰后’,‘丰后’,‘香瑞白’,‘北京玉碟’和‘粉红朱砂’为材料,对5个梅花品种在干旱胁迫下的耐受能力进行了评价,利用转录组测序技术解析梅花响应干旱胁迫的重要生物学过程和关键基因,通过外源施加激素探究褪黑素在梅花响应干旱胁迫时的作用,并结合基因克隆、亚细胞定位、荧光定量和稳定转化烟草等方法验证褪黑素生物合成途径的关键基因功能。主要结果如下:(1)不同的梅花品种对干旱胁迫的响应存在差异。干旱胁迫使5个梅花品种叶片出现不同程度的卷曲和黄化的现象。干旱胁迫条件下,5个梅花品种的叶片相对含水量和叶绿素含量呈现下降趋势,‘淡丰后’叶片相对含水量降幅最小、‘香瑞白’叶绿素含量降幅最小;可溶性糖含量和脯氨酸呈上升趋势,‘丰后’可溶性糖含量变化幅度最大、‘香瑞白’脯氨酸含量变化幅度最大;丙二醛含量和抗氧化酶活性呈现上升趋势。综合评价5个梅花品种的耐旱性,‘淡丰后’耐旱性较强,‘丰后’、‘香瑞白’、‘北京玉碟’次之,‘粉红朱砂’的耐旱性较弱。(2)‘淡丰后’在干旱胁迫下内源ABA、褪黑素和细胞分裂素含量显著提高。基于内源激素和生理指标的变化,对‘淡丰后’在干旱胁迫不同阶段及复水后的叶片转录组数据进行分析,结果表明ABA代谢、褪黑素生物合成、淀粉和蔗糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氧化还原等过程在梅花响应干旱胁迫时发挥重要作用。获得的候选基因包括PmNCED3、PmCYP707A1、PmASMT1、PmT5H1、PmSUS1、PmTPS6、PmP5CS等。(3)褪黑素能够增强梅花的耐旱能力。通过外源施加褪黑素的方法,本研究发现褪黑素预处理可以通过促进梅花内源褪黑素和ABA积累,增强抗氧化酶POD、CAT、APX活性,提高抗氧化活性物质AsA、GSH、GSSG的含量,降低活性氧含量和膜脂过氧化程度,调控褪黑素合成基因和抗氧化酶编码基因的表达,增强梅花的耐旱性。(4)克隆了梅花褪黑素生物合成途径的关键基因PmASMT1,对该基因的功能进行了验证。该基因编码354个氨基酸,具有O-甲基转移酶结构域和S-腺苷甲硫氨酸结合位点。荧光定量结果表明,PmASMT1在梅花响应干旱胁迫时显著上调表达。将PmASMT1稳定转化烟草,结果表明梅花的PmASMT1能够显著提高转基因烟草内源褪黑素含量、可溶性糖含量、抗氧化酶(SOD、POD、APX、CAT)活性以及促进NtRD29A、NtDREB2A等基因的表达,增强转基因烟草的耐旱能力。(5)对褪黑素生物合成的关键基因PmT5H1进行克隆,该基因编码514个氨基酸,具有CYP71-like结构域,属于CYP450家族成员。基因表达模式分析表明,干旱胁迫显著诱导梅花PmT5H1基因上调表达。将PmT5H1稳定转化烟草,发现PmT5H1基因能够通过调节转基因烟草内源褪黑素含量、提高抗氧化酶活性、降低丙二醛含量和诱导逆境胁迫响应基因的表达显著提高烟草的耐旱性。本研究的结果为梅花的耐旱育种研究提供了理论依据,为使用分子育种方法提高梅花对干旱胁迫的抵抗能力奠定了基础。
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