金黄色葡萄球菌所致的感染如今已被广泛认为是严重的医疗事件和公共卫生问题，不断出现的因携带杀白细胞素金葡菌感染所致的重症坏死性肺炎，其居高不下的病死率更引起了医学界的高度重视。如今，其感染已广泛散布全球，但因细菌毒素的检测非常规检查，我们国家缺乏相应的大规模调查资料，因此加强国内产杀白细胞素金葡菌流行病学调查，耐药监测，深入了解杀白细胞毒素在重症肺炎发病中的变化特点及其作用机制尤为重要。鉴于其确切发病机制远未阐明，我们从2004年起开始收集临床分离的呼吸道来源的金葡菌，采用PCR方法分离携PVL基因会葡菌，对其耐药性，来源及所致相关病情变化进行了探讨并继续开展本课题的研究。为进一步探讨杀白细胞素生物学功能及致病机制，我们通过构建杀白细胞毒素的原核表达系统，体外获取大量纯化的P-V杀白细胞素；同时，建立小鼠肺炎模型，从小鼠肺组织的病理学改变，炎症细胞因子的变化，肺部信号转导途径等方面探讨金葡菌P-V杀白细胞素在发病时基因调控机制与炎症反应的致病分子机制，从而为携杀白细胞素金葡菌感染的临床防治提供新的理论依据。 1.产杀白细胞素金葡菌筛选，基因分型，药敏及流行病学调查受试菌株：2004年7月-2008年1月中山大学附属第三医院从肺炎患者下呼吸道标本中分离的310株金黄色葡萄球菌。菌株鉴定：头孢西丁药物敏感试验及凝固酶试验鉴定MRSA。 药物敏感试验：根据CLS12006年版，用K-B纸片扩散法测定菌株对下列14种抗生素药物敏感性，包括苯唑西林、青霉素、环丙沙星、莫西沙星、红霉素、克林霉素、四环素、复方新诺明、利福平、庆大霉素、氯霉素、头孢西丁、夫西地酸、万古霉素等。 实验菌株：对经PCR方法鉴定为携PVL基因的菌株进行基因分型，对其进行同源性分析，使用SPSS11.0统计软件进行聚类分析。 结果提示：近4年所收集的携PVL金葡菌占7.4％。在这些收集的菌株中，MRSA的比例占据60.9％，未发现对万古霉素耐药。携PVL菌株90％以上对利福平敏感。莫西沙星敏感率较高，50％以上的菌株对氨基糖苷类，β内酰胺类、氟喹诺酮类，复方磺胺甲嗯唑，克林霉素和红霉素等耐药。携PVL菌株从其来源看，主要分布在呼吸科及其重症病房，器官移植科等。说明携PVL菌株感染的患者病情多半较重，并可能发生在免疫功能受损的患者。基因分型结果表明，携PVL菌株来源于不同的克隆株，在我院呈散发分布，未造成流行传播。 2.金葡菌P-V杀白细胞毒素的原核表达及对人多形核白细胞的杀伤效应研究 利用PCR方法从产杀白细胞毒素金葡菌临床分离株的基因组DNA中克隆PVL-S和PVL-F基因序列，分别将其克隆到载体pET22b中，构建重组pET22b-LuKS和pET22b-LuKF原核表达载体，转化感受态大肠杆菌BL21pLysS，异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达，将其可溶性表达经镍离子螯合亲和层析纯化后，通过对外周血粒细胞和多形核白细胞的刺激反应鉴定其活性。 结果：通过PCR方法获得PVL-S和PVL-F基因片段，与克隆载体连接后测序与文献报道的一致：成功构建了pET22b-LuKS和pET22b-LuKF原核表达质粒，并高效诱导表达出相对分子质量(Mr)约34000的S蛋白及相对分子质量(Mr)约35000的F蛋白；重组蛋白均在37℃时经IPTG诱导后以包涵体形式存在，而30℃时部分出现可溶性表达，部分为包涵体。将上清可溶性重组蛋白作用于外周血多形核白细胞，可导致多形核白细胞出现调亡，部分出现坏死。 上述结果提示，我们成功构建了表达载体pET22b-LuKS和pET22b-LuKF，对其编码的S片断和F片断进行了原核表达和鉴定，高效可溶性表达了杀白细胞毒素的S和F两类蛋白，为进一步对其致病机制和免疫原性的研究奠定基础。 3.重组rPVL及携带PVL金葡菌致小鼠肺炎模型的建立 实验动物采用BALB/c小鼠，6-8周龄，雌性，体重18～22g。将动物随机分为5组，每组20只：分别为A组小鼠，B组小鼠，C组小鼠，D组小鼠，E组小鼠。采用间断鼻腔内滴入毒素或菌株致病。接种后观察动物生存状态，死亡情况，外周血白细胞及中性粒细胞变化，肺组织病理等。 结果A组小鼠：可致小鼠发病，但停止给予毒素后，小鼠2-3天可自行恢复，致病高峰期在第六天出现。B组小鼠：可致小鼠发病，于第8，10天陆续死亡。C组小鼠：单一菌液不能致小鼠发病。D组经预处理，先给予腹腔注射地塞米松，抑制其免疫系统后，再予菌液滴鼻，第二天起病，第五天陆续有小鼠死亡(死亡小鼠再补做)。E组小鼠：小鼠无死亡。 各实验小组取样时间为小鼠处理后后第2天，第4天与第6天。结果提示：与C组和对照组E组比较，可观察到A、B、D三组小鼠致病后出现厌食，体重下降，呼吸急促，外周血白细胞出现变化。第四天各组肺组织病理检查提示，A组小鼠肺组织部分肺叶受累，肺泡结构轻度破坏，少量炎症细胞浸润。重组毒素停止给予后第5天肺病理提示肺组织恢复正常。B，D两组小鼠肺病理可见双侧多肺叶受累，肺泡结构破坏，肺内炎症细胞大量浸润伴出血、水肿，符合重症肺炎的临床表现。 本实验方法可成功复制产杀白细胞毒素金葡菌致小鼠重症肺炎的动物模型；建立了以DXM为免疫抑制剂，PVL阴性金葡菌感染小鼠肺炎动物模型，建立了以PVL重组毒素所致小鼠肺炎模型，为进一步研究杀白细胞素的致病机制奠定基础。 4.重组杀白细胞素对小鼠肺部炎症机制影响的实验研究 利用上述制作的重组rPVL及携带PVL金葡菌致小鼠肺炎模型，检测小鼠气道在滴入激发物后，分别在第2天，第4天，第6天，取小鼠肺泡灌洗液，采用ELISA法检测小鼠肺泡灌洗液细胞因子等；第2天，第4天疾病进展期肺组织JAK2、STAT1及PI3K110a等免疫组化检测。对A，B，D，E四组小鼠进行对比分析和统计处理。从肺组织黏附分子，炎症介质及抗炎介质，炎症信号通路的启动等方面探讨携PVL金葡菌感染及其杀白细胞素对机体肺部的致病分子机制。 结果显示疾病整个过程中，A，B两组小鼠与D，E两组小鼠比较，肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-12/P40、IL-10、TNF-α、sICAM-1，sVCAM-1，IL-8均持续明显升高，差异具有统计学意义(p<0.05)；对于IL-8，sVCAM-1，TNF-α，A，B两组未见有差异(p>0.05)；A，B两组IL-12/P40比较有差异(p<0.05)。D组小鼠加用了DXM，抑制了IL-8，IFN-γ，IL-12/P40等产生，与E对照组比较未见差异(p>0.05)，但不影响IL-10，sICAM，sVCAM等产生，与E组比较有明显差异(p<0.05)。肺组织免疫组化结果提示：从第2天起A、B、D三组JAK1、STAT1及P13K110a即有阳性表达，到第4天阳性表达继续升高达峰值，A，B两组小鼠与D，E两组小鼠比较，肺组织JAK1、STAT1、及PI3K110a阳性表达差异有统计学意义(P<0.05)。A，B两组小鼠JAK1、STAT1及PI3K110a阳性表达差异无统计学意义(P>0.05)。 研究提示与PVL阴性菌株感染不同的是，重组毒素组(A组)与携PVL菌株组(B组)所导致的急性坏死性肺炎早期即存在细胞因子的明显升高，意味着携PVL金葡菌感染早期即存在发生细胞因子失控性释放，从而引起导致肺组织及其他器官的损伤，证实了杀白细胞素除了其直接的杀伤炎症细胞的毒性外，同样也是一些炎症介质和细胞因子的强诱导剂，可以促进炎症细胞因子的大量合成和释放。但对于IL-12/P40而言，纯化的rPVL诱导其产生的能力低于携PVL基因的金葡菌。肺组织JAK1、STAT1、及PI3K110a等免疫组化检测表明，rPVL可通过激活JAK/STAT1途径和PI3K/AKT炎症信号途径，从而引起细胞因子失控性释放，以上研究为治疗携PVL金葡菌感染所致的重症坏死性肺炎提供新的治疗靶点。 (1)对我院近4年临床肺炎患者下呼吸道分离的310株金葡菌中杀白细胞素的分布，药敏和同源性进行了分析。经PCR分离到23株携PVL金葡菌，药敏提示未发现对万古霉素耐药金葡菌，携PVL金葡菌多为MRSA(占60.9％)，对临床常用抗生素多重耐药；基因分型结果表明，携PVL菌株来源于不同的克隆株，在我院呈散发分布，未造成流行传播。 (2)成功构建了原核表达载体pET22b-LuKS和pET22b-LuKF，对其编码的S片断和F片断进行了原核表达和鉴定，高效表达了杀白细胞毒素的S和F两类蛋白，重组蛋白对多形核白细胞有明显的杀伤效应。 (3)成功复制了以PVL重组毒素和携PVL金葡菌感染所致小鼠重症肺炎的动物模型；建立了以DXM为免疫抑制剂，PVL阴性金葡菌感染小鼠肺炎动物模型。 (4)首次从小鼠模型揭示携PVL金葡菌感染及其杀白细胞素在疾病早期即存在细胞因子失控性释放，表现为感染携PVL毒素金葡菌和rPVL小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-12/P40、IL-10、TNF-α、sICAM-1，sVCAM-1，IL-8均持续明显升高。证实了杀白细胞素除了其直接的杀伤炎症细胞的毒性外，同样也是一些炎症介质的强诱导剂。携PVL毒素金葡菌和rPVL均可激活JAK/STAT1途径和PI3K/AKT炎症信号途径，继之引起细胞因子的失控性释放，以上为治疗携PVL金葡菌感染所致的重症坏死性肺炎提供新的治疗靶点。