【摘 要】
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Sortase是存在于革兰氏阳性细菌中的一类生物转肽酶,在金黄色葡萄球菌中,Sortase A(SrtA)通过特异性地识别蛋白底物C末端保守序列LPXTG(X代表任意氨基酸),断裂苏氨酸和甘氨酸之间
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Sortase是存在于革兰氏阳性细菌中的一类生物转肽酶,在金黄色葡萄球菌中,Sortase A(SrtA)通过特异性地识别蛋白底物C末端保守序列LPXTG(X代表任意氨基酸),断裂苏氨酸和甘氨酸之间的肽键,形成酶和底物的硫酯中间产物,然后在N端为甘氨酸的亲核蛋白底物的攻击下,取代SrtA,通过形成肽键实现两个蛋白之间的共价连接,将蛋白展示在细胞表面。鉴于SrtA的特异性以及反应条件的温和性,进一步分析其底物谱,扩大其应用范围具有重要意义。本论文主要包含三部分: 第一部分,发明了一种高通量分析SrtA底物谱的方法。我们构建了针对SrtA7M(较天然SrtA有7个氨基酸突变的高活性SrtA突变体)识别序列LPATG的底物文库(XXAXG),发明了一种以酶介导的蛋白片段互补技术为基础的简单、快速、高通量、高灵敏性的多肽连接酶底物谱分析方法。利用此方法,不仅发现了已知的所有不同活性的SrtA7M底物,而且还发现了一系列具有不同活性的全新底物,证明了此分析系统的可行性,提供了一种简单、快速、高灵敏、高通量的底物筛选方法。 第二部分,设计发明了一种新型的酶进化系统。利用SrtA转肽酶,通过整合酵母表面展示技术,酶介导的生物连接技术以及荧光激活细胞分选技术,我们建立了一种多肽/蛋白连接酶体外定向进化的系统。利用此系统,我们成功筛选到了具有极高生物活性的连接酶SrtA7M,初步验证了这套系统的可行性。 第三部分,利用SrtA7M对多种T细胞进行了表面标记、修饰。借助SrtA7M广谱的底物识别序列,实现了对多种T细胞表面蛋白的体外标记,并且尝试通过LC-MS分析被标记的表面蛋白。 通过本论文的研究,我们对SrtA7M的识别底物有了更加彻底的认识,对酶活性和底物识别序列特异性有了整体性的把握。显而易见,掌握转肽连接反应的最佳底物识别序列以及最优亲核底物等信息,对更加有效地将SrtA7M应用在生物连接等方面至关重要。在本论文中,我们不仅发明了一种新的方法,实现了针对SrtA7M的高通量底物谱分析,发现了一些新型的SrtA7M转肽酶识别底物,还进一步建立了一种新型的酶进化体系用于转肽酶的进化。在此基础上,将SrtA7M应用在T细胞的体外修饰,具有一定的临床应用价值。
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