研究背景和目的:p53是重要的抑癌基因之一,i ASPP是新发现的能特异性抑制p53正常抑癌功能的蛋白,我们课题组前期研究发现,i ASPP能通过与p53的结合,从而抑制p53的正常抑癌功能。因此,解除i ASPP与p53的结合,释放出游离的p53,可能是恢复或激活p53的正常抑癌功能的有效方法。本项目利用p53衍生肽A34能与p53竞争i ASPP结合位点的特性,采用报告基因、CHIP、体外转录翻译、免疫共沉淀、流式细胞、移植瘤模型等技术,从体内体外两方面研究A34与i ASPP的相互作用,观察A34过表达对细胞生长、增殖和凋亡的影响以及对前凋亡基因表达和启动子活性的影响,阐明小分子肽A34在恢复和重建p53抑癌功能中的作用和机制。由于野生型p53存在于50%的人类肿瘤中,因此本课题的实施为使用小分子肽阻断p53和i ASPP的结合,恢复和重建p53抑癌功能提供了新的思路。方法:第一部分小分子肽A34对肿瘤细胞生物学行为的影响1.小分子肽对肿瘤细胞凋亡的影响:(1)针对于不同p53表达的肿瘤细胞,培养细胞U2OS、MKN-45、H1299、敲除p53基因的U2OS细胞,转染EX-GFP-MO1阴性对照质粒和A34阳性质粒后,Annexin V-FITC/PI染色,双染后流式细胞术测细胞凋亡,检测小分子肽A34对细胞凋亡的影响。(2)培养肿瘤细胞,转染EX-GFP-MO1阴性对照质粒和A34阳性质粒,DNA Ladder分析细胞凋亡。2.小分子肽对肿瘤细胞生长增殖的影响:培养表达野生型p53肿瘤细胞U2OS,转染阴性对照质粒EX-GFP-MO1和阳性质粒A34,CCK8检测细胞增殖。第二部分小分子肽A34、i ASPP、p53之间的相互作用1.体外翻译转录实验:制备质粒,构建p53、i ASPP、A34体外翻译转录体系,免疫沉淀后用i ASPP抗体、p53(DO-1)抗体、His抗体作为一抗做WB,检测p53、i ASPP、A34三者在体外的相互作用关系。2.免疫共沉淀实验:培养肿瘤细胞,转染质粒A34,转染后细胞提蛋白,用i ASPP抗体(自制)、His抗体及无关抗体做免疫沉淀实验,用i ASPP抗体、p53(DO-1)抗体、His抗体作为一抗做WB,检测在细胞体内A34、i ASPP、p53三者之间的相互作用关系。第三部分小分子肽A34影响肿瘤细胞生物学行为的机制1.小分子肽对凋亡基因启动子Bax/Puma转录功能的影响:培养不同类型p53的肿瘤细胞U2OS、MKN-45、U2OS(p53-/-),准备质粒EX-GFP-MO1、A34、p GL3-basic-Bax promoter、p GL3-basic-Puma promoter、p RL-SV40,将质粒转染到以上三种细胞内,检测Bax/Puma报告基因,检测小分子肽对报告基因转录活性的影响。2.小分子肽与凋亡基因启动子Bax/Puma结合能力的影响:(1)培养肿瘤细胞,转染阴性对照质粒EX-GFP-MO1和阳性质粒A34后做CHIP实验,检测小分子肽对Bax/Puma基因DNA片段结合的影响。(2)培养肿瘤细胞,转染阴性对照质粒EX-GFP-MO1和阳性质粒A34,提RNA后转c DNA,设计Bax、Puma引物做PCR实验,此实验来检测小分子肽对表达野生型p53的肿瘤细胞的Bax和Puma的m RNA影响。(3)培养肿瘤细胞,转染阴性对照质粒EX-GFP-MO1和阳性质粒A34,转染后提蛋白,用兔抗体bs-0127R和bs-1573R分别与Bax和Puma进行免疫沉淀实验,GAPDH作为上样量对照,此实验来检测小分子肽对表达野生型p53的肿瘤细胞的Bax和Puma蛋白质水平的影响。第四部分小分子肽A34对裸鼠肿瘤生长的影响1.胃癌MKN-45裸鼠移植瘤体内实验(1)向四周大的BALB/C雄性裸鼠注入胃癌细胞MKN-45细胞悬液,构建裸鼠移植瘤模型。成瘤后随机分组(每组不少于6只),每两天向瘤体内注射质粒溶液并记录瘤体的大小,注射六次后处死裸鼠并取瘤体,放入甲醛固定液中待用,统计瘤体大小。(2)将取出的瘤体做石蜡包埋并做切片,切片后做HE染色。2.骨肉瘤U2OS移植瘤体内实验:向四周大的BALB/C雄性裸鼠注入骨肉瘤细胞U2OS细胞悬液,观察成瘤情况。结果:第一部分小分子肽A34对肿瘤细胞生物学行为的影响1.Annexin V-FITC和PI双染后,流式细胞术测细胞凋亡,对于转染阳性质粒A34的表达野生型p53人骨肉瘤细胞U2OS和胃癌细胞MKN-45,凋亡明显高于转染阴性对照质粒EX-GFP-MO1和全空白的肿瘤细胞U2OS、MKN-45。2.Annexin V-FITC和PI双染后,流式细胞术测细胞凋亡,对于转染阳性质粒A34的U2OS(p53-/-)和不表达p53蛋白的人肺癌细胞H1299,凋亡率与转染阴性对照质粒EX-GFP-MO1和全空白的肿瘤细胞U2OS(p53-/-)、H1299无明显差别。3.DNA Ladde分析细胞凋亡,转染阳性质粒A34的人骨肉瘤细胞U2OS的凋亡DNA片段明显高于转染阴性对照质粒EX-GFP-MO1。4.CCK8检测细胞增殖,转染阳性质粒A34的人骨肉瘤细胞U2OS增殖速度慢于转染阴性对照EX-GFP-MO1和全空白的U2OS细胞。第二部分小分子肽A34、i ASPP、p53之间的相互作用1.体外翻译转录实验,随着A34质粒由0-10μl增加到35μl,p53明显减少,可见A34能竞争i ASPP结合p53,A34能与i ASPP相互作用。2.免疫共沉淀实验,A34不与p53作用,但可与i ASPP作用。第三部分小分子肽A34影响肿瘤细胞生物学行为的机制1.报告基因实验,在U2OS和MKN-45细胞中,小分子肽A34能提高p53对Bax/PUMA启动子的的转录活性,但对U2OS(p53基因-/-)细胞却无此影响。2.CHIP实验,通过抗p53抗体(DO-1)产生的免疫沉淀物,特异性地检测到了启动子Bax和PUMA的序列,但空白载体组Ig G抗体产生的免疫沉淀物则无法检测到这些序列。空白载体转染的细胞中,Bax和PUMA启动子序列数量无变化。A34转染的细胞中,Bax和PUMA启动子序列数量分别是空白载体组的1.54倍和1.34倍。3.U2OS细胞转染A34后,Bax和PUMA的m RNA水平和蛋白质水平得到提高。第四部分小分子肽A34对裸鼠肿瘤生长的影响1.相对于M01处理组和生理盐水处理组的肿瘤继续生长,A34处理组的肿瘤生长速度减慢,由此表明A34能减慢移植肿瘤的生长速度。2.HE染色后,A34阳性组可见坏死病灶。结论:本课题探讨了小分子肽A34在重建p53抑癌功能中的作用和机制1.通过流式细胞术检测细胞凋亡的实验,发现在p53表达的肿瘤细胞中转染A34肽段可提高肿瘤细胞凋亡率,p53缺失的肿瘤细胞转染A34则无明显变化。因此,可推断小分子肽A34是在肿瘤细胞p53表达的前提下,才可提高细胞凋亡率。2.通过DNA Ladder实验,发现A34可提高肿瘤细胞凋亡率。3.通过CCK8实验,发现A34能降低肿瘤细胞增殖率。4.通过体外翻译转录实验,发现A34能完全与i ASPP结合,继而使p53从i ASPP中游离下来。5.通过免疫共沉淀实验,发现在细胞内A34不与p53作用,但可与i ASPP作用。即A34可以和p53竞争与i ASPP的结合,将p53游离出来。6.通过报告基因实验,发现小分子肽A34增强凋亡基因启动子Bax和PUMA的转录活性这一功能是基于p53基因。7.通过染色质免疫共沉淀(CHIP)实验,证实了A34具有增强p53与Bax/PUMA的DNA结合的能力的作用。8.通过检测U2OS细胞转染A34后Bax和PUMA的m RNA和蛋白质水平,均表明A34能增强p53与DNA结合的能力,并提高Bax和PUMA的m RNA水平和蛋白质水平,最终导致程序性细胞死亡。9.通过体内动物实验,裸鼠移植瘤模型的建立,A34能减缓移植瘤的生长速度。10.通过体内动物实验,瘤体HE染色,可见转染A34的瘤体有坏死组织。