第一部分HIF-1α、VEGF及MvD在肝细胞癌中的表达及临床意义缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）作为一种重要的转录激活因子,能诱导多种缺氧反应性表达,可促进包括血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Fatcor,VEGF）在内的多种血管生长相关基因转录,促进肿瘤血管生成,并在促进肿瘤细胞增殖和转移、调节糖代谢、增加肿瘤耐药性等方面发挥重要作用,与肿瘤的发展与转移密切相关。其中,HIF-1α是HIF-1的活性亚基。为进一步探讨HIF-1α在肝细胞癌（HepatocellularCarcinoma,HCC）发生、发展和转移中的作用,本研究将在第一部分采用免疫组化方法观察人HCC及癌旁组织中HIF-1α、VEGF及微血管密度（microvesseldensity,MVD）的表达及其临床意义。材料和方法1、一般资料收集2005年12月—2006年12月浙江大学医学院附属第一医院手术切除肝脏标本55例,并经病理检查证实。其中HCC组织45例,并取距离肿瘤边缘1cm处组织为癌旁组织。正常肝脏组织10例。2、主要试剂HIF-1α鼠抗人多克隆抗体,购自Lab Vision公司:VEGF鼠抗人多克隆抗体,购自长岛生物技术公司;CD34鼠抗人多克隆抗体,购自长岛生物技术公司;PV9000试剂盒,购自北京中山生物技术公司。3、实验方法HIF-1α、VEGF、CD34采用免疫组化PV9000二步法,染色步骤按试剂盒说明书进行。4、结果判断HIF-1α染色综合染色强度和阳性细胞占总细胞数的百分比进行半定量评分。染色强度:1分,染色弱但明显强于阴性对照;2分,染色清晰,中等程度;3分,染色程度强。阳性细胞数:2分,阳性细胞占11-50%;3分,阳性细胞占51-80%;4分,阳性细胞＞81%。上述两项评分相加,不论染色强度,阳性细胞≤10%为（-）,3分为（+）,4-5分为（++）,6-7分为（+++）,其中以（++）和（+++）为强阳性。VEGF判别标准为:随机选择5个视野,计算100个细胞/视野,共计500个,阳性细胞≦10%为阴性,阳性细胞＞10%为阳性。微血管密度（MVD）计数方法:在200倍高倍镜下随机选择4个不同视野计数,计算每例标本的单位视野平均血管数。5、统计学处理数据统计在SPSS 13.0统计软件上进行。样本率的比较采用X²检验;计量资料两样本均数比较t检验:多个样本均数比较采用单因素方差分析;参数间相关性采用Spearman等级相关分析。以P＜0.05为差异有显著性。结果1、HIF-1α、VEGF与MVD在HCC、癌旁及正常组织中的表达HIF-1α在HCC组织中广泛表达,与正常及癌旁组织比较,HIF-1α表达显著增高,表达阳性率和强阳性率分别为91.1%和68.9%。在癌旁组织中,表达阳性率和强阳性率分别为20.0%和6.7%。10例正常组织中,仅1例阳性。癌旁组织与正常组织比较,差异无显著性。VEGF在HCC中表达阳性率为53.3%;在癌旁组织中,表达阳性率为13.3%。而正常组织中均为阴性表达。与正常及癌旁组织比较,HCC组织中VEGF表达显著增高。与正常组织比较,癌旁组织中VEGF表达差异无显著性。HCC组织MVD值较癌旁、正常组织明显增高,为52.2±18.3;癌旁组织与正常组织的MVD值分别为23.2±9.8和16.5±9.7,差异无显著性。2、HCC中HIF-1α、VEGF表达及MVD与临床病理的关系在HCC中,HIF-1α表达强阳性率在高分化、中分化和低分化HCC分别为16.7%、62.5%和100.0%,差异具显著性;在伴门脉癌栓形成和无癌栓形成HCC组织中,HIF-1α强阳性率分别为100.0%和60.0%;在瘤体直径＞5cm和≤5cm HCC组织中,HIF-1α强阳性率分别为86.3%和52.2%,组间差异均具统计学意义。而随远处转移的发生,HIF-1α表达阳性程度有增高趋势,但无统计学意义。VEGF表达随HCC组织分型减低呈增高趋势,但无统计学意义。在伴门脉癌栓形成和无癌栓形成HCC组织中,VEGF表达阳性率分别为90.0%和42.9%,差异具显著性。VEGF表达随远处转移发生、肿瘤体积增大而增高,但无统计学意义。在高分化HCC和低分化HCC组织中,MVD均值分别为40.5±14.8和61.0±17.2,差异具显著性。在伴发门脉癌栓形成、远处转移发生HCC组织中,MVD均值分别为71.3±12.7和64.1±12.2,与无门脉癌栓形成（46.8±16.0）和远处转移发生（49.7±18.5）HCC组织相比,组间差异具有统计学意义。MVD均值随肿瘤体积增大而增高,但无统计学意义。3、HCC癌旁HIF-1α、VEGF表达及MVD与临床病理的关系在伴门脉癌栓形成和无癌栓形成的癌旁组织中,HIF-1α表达阳性率分别为50.0%和11.4%,差异具显著性。随远处转移发生、伴发肝硬化、HCC组织分型减低,表达阳性程度有增高趋势,但无统计学意义。VEGF表达随门脉癌栓形成、远处转移发生、HCC组织分型减低、伴发肝硬化呈增高趋势,但无统计学意义。在低分化HCC癌旁组织,MVD均值为28.5±10.6,与高分化（16.6±7.1）和中分化（21.6±8.4）HCC癌旁组织相比,差异具有统计学意义。在伴发门脉癌栓形成、远处转移发生及肝硬化的癌旁组织中,MVD均值分别为33.7±5.6、31.5±9.5和26.2±10.8,与无门脉癌栓形成（20.2±8.6）、无远处转移发生（21.4±8.7）及不伴肝硬化（20.1±7.6）癌旁组织相比,组间差异具有统计学意义。4、HIF-1α与VEGF、MVD表达的关系在HCC中,HIF-1α阳性表达程度与VEGF表达、MVD均值有显著的正相关性（r=0.545,r=0.705）。HIF-1α表达（+）、（++）和（+++）癌组织中MVl)分别为36.5±7.9、53.8±14.3、75.3±9.1。VEGF阳性表达的HCC组织其MVD（64.1±15.9）明显高于VEGF阴性HCC组织（38.7±10.9）,VEGF阳性表达程度与MvD呈正相关（r=0.710）。在HCC癌旁组织中,HIF-1α表达与VEGF表达、MVD值同样具有相关性（r=0.784,r=0.608）。HIF-1α阴性与HIF-1α阳性表达癌旁组织的MVD值分别为20.0±7.6和36.0±6.2。VEGF阳性表达的癌旁组织MVD值为38.5±6.0,明显高于VEGF阴性癌旁组织（20.9±7.9）,VEGF阳性表达程度与MVD呈正相关（r=0.554）。本研究采用免疫组化PV9000二步法检测肝组织中HIF-1α,VEGF和MVD的表达,结果表明:1、HIF-1α,VEGF和MVD在HCC肿瘤组织中表达上调,与癌旁组织以及正常肝组织有显著性差异。提示上述各种因子可能在HCC发生发展过程中起重要作用。2、HIF-1α,VEGF和MVD表达上调与HCC临床病理特征有一定的相关性。其中,HIF-1α表达与肿瘤组织分型、肿瘤体积、门脉癌栓形成密切相关;VEGF表达与门脉癌栓形成密切相关;MVD与肿瘤组织分型、肿瘤远处转移、门脉癌栓形成密切相关。3、HIF-1α,VEGF和MVD在HCC肿瘤组织及癌旁组织中的表达具有相关性。第二部分HIF-1αAS-ODN对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用由于HIF-1α在肝癌发生、发展与转移中的关键作用,HIF-1α可能成为肝癌治疗的新靶向,在抑制肝癌血管生成、抑制肝癌细胞增殖和转移、降低肝癌细胞对缺氧的耐受性等环节中发挥作用。反义寡核苷酸（antisenseoligodeoxynucleotides,AS-ODN）是人工合成的单链小片段核苷酸,能在转录水平或翻译水平特异性地抑制靶基因的表达,以达到治疗效果。为进一步研究HIF-1αAS-ODN对肝癌细胞生长的抑制作用,本研究将在第二部分实验中设计和合成若干条HIF-1αAS-ODN,以脂质体介导转染HepG2细胞,观察AS-ODN对肝癌细胞增殖的抑制作用,选择出细胞生长抑制效应最强的AS-ODN,并进一步验证该AS-ODN对肝癌细胞靶基因HIF-1αmRNA转录和翻译的抑制作用。材料与方法1、实验材料HIF-1αAS-ODN_1-6,由北京军事医学科学院放射研究所设计、合成、修饰和纯化。HIF-1αRT-PCR引物,北京军事医学科学院放射研究所合成。PCR反应试剂盒,购于美国Promega公司;Trizol RNA提取试剂盒、购于Gibco BRL公司;HIF-1α抗体（一抗和二抗）,购自stressgen公司;β-actin抗体（一抗和二抗）,购自Santa CruzBiotechnology公司。2、实验方法2.1脂质体寡核苷酸转染肝癌细胞HepG2培养至对数生长期后,将HepG2细胞接种到96孔板（4×10³细胞/孔/100μL）。培养至细胞贴壁且丰度达到40%～60%时,吸弃各孔中的培养液。按脂质体说明书进行AS-ODN的转染。用无血清无抗生素DMEM细胞培养液分别配制各序列及浓度寡核苷酸和阳离子脂质体溶解液,室温静置40分钟。振荡并混和寡核苷酸液和阳离子脂质体液成转染液,使脂质体充分包裹寡核苷酸。转染液混匀后滴加至细胞上,置于培养箱转染6小时。每个浓度寡核苷酸设置4个平行孔。吸弃各孔转染液,加入100μl含血清的DMEM培养液。封闭缺氧的条件下置于37℃、5%CO₂孵箱继续培养。2.2 MTS检测法脂质体寡核苷酸转染96孔板后继续培养72小时后,每孔加入20μl MTS（5mg/ml）,在微量振荡器上混匀后,置于37℃、5%CO₂孵箱继续培养90分钟后,用多功能酶标仪（Wallac美国）在492nm测定吸光值,并计算细胞增殖抑制率（Ip）。2.3 RT-PCR法脂质体寡核苷酸转染后继续培养48小时,提取HepG2细胞RNA,取2μg RNA加入20μl逆转录体系中,42℃孵育1小时反转录合成cDNA,72℃,5分钟,灭活逆转录酶,中止反应。PCR反应体系:cDNA1μl,Taq酶0.5μl,PCR mix 15μl,20μmol/L内参照β-actin和HIF-1α上、下游引物各0.5μl,去离子水补充至20μl。PCR扩增条件:94℃预循环4分钟;94℃变性30秒,56℃退火30秒,72℃延伸30秒,30个循环;最后72℃延伸5分钟。产物进行2%琼脂糖电泳。利用ImageQuant5.2软件读取各条电泳带的信号值,计算抑制率Im。2.4 Western blot检测脂质体寡核苷酸转染后继续培养48小时,提取HepG2细胞蛋白,改良Lowry法进行蛋白定量后将各组蛋白提取物调至相同浓度。取60μg/10μl蛋白与等体积2×SDS上样缓冲液混合均匀,煮沸5分钟充分变性。用8%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。凝胶行半干转移至PVDF膜。用含1%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭1小时。室温结合β-actin和HIF-1α一抗1小时,浓度比例（1:400）,用TBST洗涤;室温结合β-actin和HIF-1α二抗1小时,浓度比例（1:2000）,用TBST洗涤后加ECL显色剂反应2分钟,X光胶片成像。3、统计学处理数据统计在SPSS 13.0统计软件上进行。计量资料多个样本均数比较采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异有显著性。结果1、HIF-1αAS-ODN细胞水平活性筛选脂质体法AS-ODN转染HepG2细胞72小时后,采用MTS检测法测定各序列对HepG2细胞增殖的抑制率。结果显示,与脂质体对照组相比,AS-ODN_1-6各序列均可以显著抑制HepG2细胞的增殖（p＜0.01）,随剂量增大,抑制作用呈增强趋势,当浓度为0.8μmol/L时,AS-ODN_1-6的细胞增殖抑制率分别达57.2±2.4%、61.8±1.9%、57.4±2.6%、49.1±3.4%、53.3±3.1%和53.7±2.7%。尤其是AS-ODN₂当浓度为0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.8μmol/L时,细胞增殖抑制率分别为37.8±2.0%、49.2±1.7%、61.8±1.9%;与其它反义链相比,AS-ODN₂抑制HepG2细胞增殖作用更明显,具有显著性差异（p＜0.05）。因此我们筛选出AS-ODN₂作为反义药物继续以下研究。2、HIF-1αAS-ODN₂对HepG2细胞增殖的抑制作用在AS-ODN₂对细胞增殖抑制作用的实验中,设置0.2、0.4、0.8、1.0μmol/L四个剂量,结果显示,与S-ODN相比,AS-ODN₂可以显著抑制HepG2细胞的增殖（p＜0.01）;随剂量增大,抑制作用呈增强趋势,当浓度达到1.0μmol/L时,细胞增殖抑制率达89.7±3.8%。3、HIF-1αAS-ODN₂对HepG2细胞HIF-1αmRNA表达的抑制作用脂质体法AS-ODN₂转染HepG2细胞48小时后,采用RT-PCR法,对AS-ODN₂抑制HepG2细胞HIF-1αmRNA表达进行检测。RT-PCR产物分析结果显示,与S-ODN相比,AS-ODN₂可以明显抑制HIF-1αmRNA的表达,浓度为0.4μmol/L和0.8μmol/L时,抑制率分别为79.5%和78.2%。4、HIF-1αAS-ODN₂对HepG2细胞HIF-1α蛋白表达的抑制作用脂质体法AS-ODN₂转染HepG2细胞48小时后,采用Western blot印迹检测HIF-1αAS-ODN₂对HIF-1α蛋白表达的抑制。免疫印迹结果显示,与S-ODN和细胞对照组相比,AS-ODN₂可以显著抑制相应蛋白的表达。该抑制作用随浓度增加有增强趋势,当浓度为0.8μmol/L时,HIF-1α蛋白表达基本受到抑制。结论本研究合成6条HIF-1α硫代AS-ODN,阳离子脂质体法转染HepG2细胞,观察其对HepG2细胞增殖、HIF-1αmRNA转录及翻译的抑制作用,结果表明:1、HIF-1αAS-ODN_1-6各序列均具有不同程度抑制HepG2细胞增殖的作用,当浓度为0.8μmol/L时,AS-ODN_1-6的细胞增殖抑制率分别达57.2±2.4%、61.8±1.9%、57.4±2.6%、49.1±3.4%、53.3±3.1%和53.7±2.7%。2、与其它反义链相比,HIF-1αAS-ODN₂抑制HepG2细胞增殖作用最明显,当浓度达到1.0μmol/L时,细胞增殖抑制率达89.7±3.8%。3、HIF-1αAS-ODN₂可以明显抑制HepG2细胞HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白的表达,提示HIF-1αAS-ODN₂对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用,由通过阻断HIF-1αmRNA的转录及翻译而实现。