利奈唑胺(（S）-N-[[3-[3-fluoro-4-（4-morpholinyl）phenyl]-2-oxo-5-oxazolidinyl]methyl]-acetamid-e,PNU-100766是一种恶唑烷酮类抗生素,用于治疗由革兰氏阳性菌引起的对其他抗生素有抗药性的感染。2000年4月,美国食品和药物管理局（FDA）首次批准唑烷酮类抗生素利奈唑胺（Linezolid）用于治疗医院内肺炎、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和其他万古霉素耐药肠球菌（VRE）引起的皮肤感染。利奈唑胺最初用于治疗植物病害,是恶唑烷酮类抗生素家族中第一个已知的先导化合物。在过去的四十年里,恶唑烷酮一直被认为是临床上使用的一类全新的抗生素。利奈唑胺与细菌核糖体50S亚基结合,阻止与30S亚基、起始因子、m RNA和甲酰甲硫酰t RNA的络合。最终结果是阻止功能性蛋白质合成起始复合物的组装,从而阻止m RNA的翻译。其他蛋白质合成抑制剂如大环内酯类、氯霉素、林可酰胺类和四环素类在m RNA延长后肽延长停止的机制与利奈唑胺机制有很大不同。这种差异可能看起来是学术性的,但在两个方面,它可能值得注意。首先,利奈唑胺似乎明显有助于防止链球菌和葡萄球菌毒力因子（例如溶血素、凝固酶和蛋白A）的合成,这可能是由于其作用方式所致。其次,利奈唑胺的靶点与现有的蛋白质合成抑制剂的靶点不相关;因此,它的活性不受r RNA甲基化酶的影响,这种甲基化酶通过修饰23S r RNA来阻断克林霉素、大环内酯类化合物和B链球菌的结合。它通过与r RNA结合和干扰t RNA的正确定位来干扰细菌蛋白质的合成。对利奈唑胺治疗敏感的病原菌包括化脓性链球菌、肺炎链球菌、耐万古霉素的屎肠球菌和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。主要适应症是皮肤感染和肺炎,尽管它也用于包括抗药性结核病在内的各种其他感染。利奈唑胺的标准剂量为12岁以上的患者每天两次每次600 mg,而较年轻的患者每天三次每次10 mg/kg。该药口服后吸收迅速,吸收范围广,生物利用度约为100%。利奈唑胺为水溶性抗生素,其血浆蛋白结合率约为31%。因此,在临床稳定的患者中,利奈唑胺可以从静脉给药转换为口服给药,而不需要调整剂量;这构成了该药的主要优势。血小板减少是利奈唑胺治疗中的一个主要不良事件,在肾功能受损、长期服用利奈唑胺和血药浓度较高的患者中,血小板减少的发生率会增加。此外,单剂量或多次口服或静脉注射利奈唑胺后,AUC值有较大的变异性,成人的消除半衰期为4～10小时,在剂量递增研究中,清除率随剂量的增加呈非线性变化。因此,建议根据利奈唑胺血药浓度进行个体化剂量调整,以保证利奈唑胺治疗的安全性。其主要消除途径是两种主要代谢物（PNU-142586和PNU-142300）和亲本药物的尿排出,约占剂量的80%。唯一占剂量1%以上的其他代谢物是PNU-173558,它是PNU-142586本身代谢的主要产物。据报道,利奈唑胺的代谢要么通过通向PNU-142300的内酰胺途径发生,要么通过通向人类主要代谢物PNU-142586的内酯途径发生。后一条途径构成利奈唑胺清除的限速步骤,迄今被认为是在没有细胞色素P450等药物代谢酶参与的情况下发生的。PNU-142300和PNU-142586均不具有抗菌活性。根据已知的利奈唑胺代谢途径和非线性动力学,利奈唑胺代谢过程中可能存在一些酶或转运蛋白参与利奈唑胺代谢。我们推测,利奈唑胺可能是由人的CYPs代谢的,这些CYPs要么没有在肝脏中表达,要么之前没有进行过测试。我们以前报道过重组表达人CYPs的渗透性分裂酵母菌株（酶袋）用于外源物质的生物转化。最近,我们克隆了一套完整的57株重组分裂酵母菌株,它们在功能上表达所有的人CYPs。57种人CYP是所有膜结合蛋白,主要存在于内质网的胞质侧或线粒体内基质侧膜。需要还原CYP来催化氧化还原反应,因此取决于电子转移蛋白。线粒体中有一条短的电子转移链在内质中包括肾上腺素（Adx）和肾上腺素还原酶（Ad R）网状细胞只有一个电子转移伴侣,细胞色素P450还原酶（CPR或POR）。人类CYP代谢多种化合物,它们属于许多不同的化学类别,通常催化脂肪族或芳香族羟基化。利用这些工具,我们在本研究中系统地分析了利奈唑胺在所有人CYPs中的体外代谢。考虑到这一概念,我们想重新研究人类CYPs是否参与了利奈唑胺的主要代谢物PNU-142586的形成。为此,我们修改了先前发表的利奈唑胺代谢途径,并对其进行了系统分析。为了对利奈唑胺代谢进行系统分析,我们制作了一个包含鸡尾酒等级的测试树。在这棵鸡尾酒测试树上,Master-Cockail（M）装着由所有57个人CYPs单独斑点制成的酵素袋。大师级鸡尾酒自上而下分为亚酶袋鸡尾酒A、B、C、D,每组含有14或15种单独的酶。在这四种亚鸡尾酒中,我们根据CYP命名法选择了每种酶;例如,鸡尾酒A含有CYP1A1到CYP2F1,鸡尾酒B含有CYP 2J2到CYP4F3,等等。在层次结构的第三层,有12种鸡尾酒,从1到12种,每种都包含一个由四到五个选定的CYPs单独菌株制成的酶袋,并根据它们的命名进行放置。方法:采用不同的化学试剂对利奈唑胺代谢进行系统分析。Triton-X100来自Leagene（中国,北京）;NADPH再生系统来自Promega（美国麦迪逊）;Tris-HCl（来自AKZ-Biotech（中国天津））;氯化钾、碳酸氢铵、磷酸二氢钾和磷酸氢钾来自江田化工（中国天津）;1X TBS缓冲液、1X PBS缓冲液来自康宁（弗吉尼亚州马纳萨斯）;所使用的所有其他化学品和试剂均为可用的最高等级。本研究中使用的所有裂殖酵母菌株的基因型都已在前面描述过。以亲本株CAD62（只表达人细胞色素P450还原酶,基因型h-ura4-D.18leu1::p CAD1-CPR）作为对照。简而言之,菌株一般在30°C的爱丁堡最低培养基（EMM）中培养,并根据需要添加0.1 g/L的最终浓度。液体培养保持在150 rpm的摇床上。硫胺素全程使用浓度为5μM。利用酶袋进行生物转化,裂殖酵母细胞在含硫胺素的EMM平板上30°C培养3 d,然后将单个酵母菌落转移到不含硫胺素的EMM液体培养基10 m L中,在30°C、230 rpm培养36h。将5×107个细胞转移到1.5 m L Eppendorf管中,制粒后加入1 m L 0.3%Triton-X100于Tris-KCl缓冲液（200 m M KCl,100 m M Tris-HCl p H 7.8）中室温230 rpm孵育60 min。为了制备鸡尾酒,将4或5个不同菌株的培养物中的等量细胞混合,以同样的方式处理5×10~7个细胞（每次检测）。酶袋用1 m L NH4HCO3缓冲液（50 mm,p H 7.8）洗涤3次后,再悬浮在含50%甘油的100μL PBS中,轻轻涡流,在液氮中闪冻,在-80°C保存至使用。生物转化采用冰冻解冻、NH4HCO3缓冲液（50 m M,p H 7.8）洗涤一次,然后加入底物和NADPH再生体系。总反应体积为50μL,最终底物浓度为100μM,孵育时间分别为3h（对于CYP2A7）和24 h（对于CYP1A1）,通过LC/MS对线性沸石代谢物与人CYPs进行分析,LC/MS由Q Exactive HF混合四极轨道质谱仪（Thermo Fisher;Waltham,美国,MA）组成,结果:为了验证CYPs是否参与利奈唑胺代谢,我们采用酶袋鸡尾酒试验方法,服用含有所有人CYPs的Master鸡尾酒（M）。将利奈唑胺和NADPH再生系统与含有人CYPs全酶袋的M鸡尾酒孵育,通过LC/MS系统对样品进行检测。为此,我们采用了一组重组表达所有人CYPs的裂殖酵母菌株。所有57个菌株的渗透细胞（酶袋）如前所述制备,并组合成一组新的12种鸡尾酒,分别含有4种或5种环磷酰胺。然后将这些酶袋鸡尾酒与利奈唑胺和NADPH孵育,并分析反应上清液中是否存在如所示的代谢物。仅在鸡尾酒1（CTA）中可发现这些代谢物,而其他鸡尾酒（CTB、CTC和CTD）均为阴性。因此,对鸡尾酒1中的5种酶进行了单独检测,发现CYP1A1和CYP2A7能将利奈唑胺代谢成全部5种代谢物,而CYP1A2、CYP1B1和CYP2A6则不能。这些体外实验证实了利奈唑胺依赖CYP1A1或CYP2A7代谢为PNU-142586以及PNU-143011、PNU-142620、PNU-143010和PNU-173558。据我们所知,这是人类主要利奈唑胺代谢物PNU-142586的酶依赖形成的第一次描述。讨论:原则上,从利奈唑胺到PNU-173558的代谢途径可以是进行型的,也可以是分布型的。在分布型中,中间反应产物离开酶的活性中心,需要再次与酶结合才能发生下一反应。然而,也有几个例子表明,人的CYPS通过过程性途径催化顺序反应,即没有活性中心释放中间产物。由于我们可以在依赖CYP1A1或CYP2A7的生物转化样本中检测到所有中间产物,因此似乎这条途径遵循分布版本。CYP1A1主要在肺中表达,因此我们的发现表明,除了肝脏外,很大一部分线虫的代谢也发生在那个器官。这一点特别值得注意,因为利奈唑胺经常用于肺部感染的治疗。已知CYP1A1基因的表达受几种转录因子的调节,如芳烃受体、Toll样受体和肿瘤抑制因子p53。此外,利奈唑胺的药代动力学是年龄依赖性的,婴儿和儿童具有更大的血浆清除率、更大的分布体积以及相应的较低的血清浓度和血清AUC;由于CYP1A1基因多态性已知会影响儿童急性淋巴细胞性白血病等某些疾病的易感性,它们也可能调节年轻患者的利奈唑胺药代动力学。有理由推测,将来利奈唑胺治疗肺部感染的成功和副作用的发生将部分取决于患者的CYP1A1活性。相比之下,CYP2A7主要在肝脏表达,是一个高度多态的基因。与CYP2A7密切相关的CYP2A6也主要在肝脏表达,已知能代谢几种临床相关的底物。本研究的附加价值:在本研究中,我们采用了一种新的系统分析方法来研究利奈唑胺代谢的所有57个人CYPs。采用分步、省时、省试剂的鸡尾酒方法,取得了令人振奋的结果。从鸡尾酒M到亚鸡尾酒,我们能够确定CYP1A和CYP2A7是利奈唑胺的代谢物。根据我们新配方的酶袋鸡尾酒研究,我们可以建议,以此作为筛选大量样品的标准方法,以节省时间、资源和个人的努力。据我们所知,这是首次有两个人CYP1A1和CYP2A7代谢利奈唑胺的研究。这两种酶都能产生PNU-142586,这是人类主要的利奈唑胺代谢物。因此,这种代谢物的形成是酶依赖性的,这一新的发现对临床上常见的利奈唑胺药代动力学的非线性有一定的意义。此外,根据这些结果,我们还可以得出结论,依赖CYP1A1的利奈唑胺代谢主要发生在两个器官,即肺（CYP1A1表达的主要部位）和肝脏（CYP2A7表达的主要部位）。所有现有证据的影响:关于在利奈唑胺治疗期间是否对某些患者进行治疗药物监测的讨论正在进行中。我们在这项研究中提供的数据表明,CYP1A1或CYP2A7活性的改变可能会影响利奈唑胺的代谢,从而导致不同的药物暴露。这种活性改变可能是由于药物-药物相互作用（如果共用化合物被任何一种酶代谢）,药物-食物相互作用（如果任何一种酶的表达水平发生变化）,或者是这两种酶编码基因的多态性造成的。利奈唑胺经常用于肺部感染的治疗,因此CYP1A1活性的变化预计对此类病例的药物暴露具有特别重要的意义。本研究之前的证据:我们在Pub Med搜索字符串“利奈唑胺”和“P450”或“CYP”搜索,查找到2020年1月22日之前以任何语言发表的文章。在我们的搜索确定的12个研究中,一些研究了细胞色素P450酶（CYPs）可能参与广谱抗生素利奈唑胺的代谢,细胞色素P450酶（CYPs）是人类主要的I期药物代谢酶。然而,没有发现证据,因此人们普遍认为利奈唑胺代谢独立于CYPs发生。