近年来,肺癌的发展十分迅速,全世界范围内每年有超过100万的患者被诊断为肺癌,其发病率和死亡率在城市恶性肿瘤中高居第一,即使是在农村也仅次于胃癌。其中非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)占肺癌比例为75%～85%,而大于65岁的老年患者占1/2以上,由于NSCLC发现时绝大部分已经处于晚期(III, IV期肺癌),其5年总生存率仅为12%-15%,因此许多患者失去了手术治疗的最佳时机。对于老年晚期NSCLC的治疗方法,首选仍然是化学药物治疗,化疗是对于无法接受手术的老年肺癌患者十分有效的治疗方式,可以有效地减少肺癌的复发和延缓病情的进展,提高临床疗效,延长患者生存期并改善其生存质量,但是由于老年患者生理代偿能力较低,并且常合并各种慢性疾病,对于治疗的耐受性较差,所以疗效常常并不尽如人意。目前针对老年肺癌病人的化疗药物种类和化疗方案种类繁多,如：顺铂、依托泊苷(VP-16)、拓扑替康、吉西他滨、紫杉醇和多西紫杉醇等,但仍然缺乏一种成熟有效的治疗方案,因此研制一种出效果良好和毒副作用小的药物成为了抗肿瘤研究的焦点。多西他赛(docetaxel, DTX)是一种紫杉醇类细胞周期特异性抗肿瘤药,可作用于G2期和M期细胞,是目前较为新型的抗微管类紫杉烷药物,也是唯一得到美国食品药品管理局(FDA)和欧盟批准用于NSCLC一线和二线治疗的化疗药物。根据许多临床研究资料证明,多西他赛对于治疗NSCLC是十分有效的。然而DTX的低水溶性仍是一个亟待解决的问题,这也严重限制了其在临床上的应用。目前的上市DTX药物中如帕多菲和艾素中,吐温80作为溶剂被应用于解决其难溶性问题,但是这常常会导致一些令患者难以忍受的副作用,如周围神经病变,溶血反应和过敏反应等这些对人体正常组织器官的非特异性毒性作用。另外,这两种市售药物由于半衰期较短,因此患者需要频繁地接受注射,极大地加重了患者的痛苦及不便,所以如何解决上述问题成为了DTX药物研究的焦点。在过去的几十年中,可生物降解白蛋白纳米粒在肿瘤靶向治疗领域中受到了越来越多的关注。根据已有的研究报道可知,纳米载药系统可以通过透过性增强和滞留效应(EPR效应)使药物更有效地聚集在肿瘤组织,从而实现药物的靶向性；此外,纳米载药系统的另一个优势就是它的半衰期很长,这使它比其它药物拥有更强的缓释性和长效性。聚乙二醇(PEG)的分子式为H(CH2CH2O)nOH,其分子结构由环氧乙烷聚合而成,理化性质具有pH中性,水溶性和亲水性高等特点。PEG具有以下优点：无毒,无免疫原性,良好的生物相容性,能够与多数蛋白多肽类、小分子药物以及脂质体等通过不同的共价键或非共价键进行偶联,改变药物的分子结构,从而改进药物的药动学和药效学的性质,是FDA批准的极少数可以作为体内注射用药的合成聚合物之一由于PEG化的这些优势,对药物进行PEG化修饰越来越受欢迎。PEG化药物具有许多优点,如：(1)延长药物半衰期,长效缓释作用；(2)改善难溶性药物的溶解性：(3)降低药物的免疫原性和抗原性,增强药物的稳定性；(4)减少酶降解作用；(5)增强药物的靶向作用；(6)降低某些药物的毒性。基于以上我们描述的白蛋白纳米粒和PEG化制剂明显优势,在本实验中,我们选择乳化挥发交联法制备了多西他赛白蛋白纳米粒(docetaxel albuminnanoparticles, DANPs)和PEG化多西他赛白蛋白纳米粒(docetaxel loaded PEG-albumin nanoparticles, PEG-DANPs)。然后我们研究了DANPs和PEG-DANPs的表征,并进行了体外方面的一系列研究,包括：体外溶血反应、体外释放及其对人非小细胞肺癌A549细胞的抑制增殖、诱导凋亡和摄取的情况；在体内方面,我们分别建立了人非小细胞肺癌移植瘤及原位癌模型,分别研究了Aisu(?)、DANPs和PEG-DANPs三种药物对移植瘤模型瘤块抑制及体重减轻情况及药物对原位癌裸鼠的抗瘤及抗转移等情况,结果证明,PEG-DANPs对于NSCLC是一种十分安全、有效的治疗药物制剂。实验方法和结果：1.乳化挥发交联法制备PEG化多西他赛白蛋白纳米粒(PEG-DANPs)DTX原料药溶于氯仿和乙醇中,白蛋白溶于无菌水中,将两者混合后移至高压乳均机内,20000 psi下进行乳化12个循环,将所得的溶液放入旋转蒸发器内使氯仿迅速除去,最终得到具有蓝色乳光的半透明状分散液,经冷冻干燥机冻干,复溶后过0.22μm膜,制成DANPs。DANPs溶于硼酸缓冲液,再加入mPEG(20000 kDa),在室温下于搅拌仪中反应3h,最后加入甘氨酸(11mg/mL)终止反应。将反应物移至70 kDa透析膜中旋转过滤半小时后冷冻,合成物干燥备用。复溶后DANPs和PEG-DANPs用碘染色及考马斯蓝染色,进行PAGE胶电泳,结果显示PEG-DANPs合成成功。2.动态光散射法测定DANPs和PEG-DANPs的粒径和电位DANPs及PEG-DANPs冻干剂复溶,利用Malvern Nano ZS激光粒度分析仪测定其粒径及电位。DANPs粒径为163.4±3.76 nm, zeta电位平均为-19.4±0.18 mV；PEG-DANPs粒径为169.19±2.36 nm, zeta电位平均为-18.2±0.21 mV,说明两种纳米颗粒大小合适,电位合理。3. Hitachi H-7650电子显微观察DANPs和PEG-DANPs的形态DANPs及PEG-DANPs冻干剂复溶,取10μL滴在蜡块表面,另取表面膜化处理的铜网正面朝下覆于液滴上,放置10 min后取下铜网,用滤纸吸干铜网表面液体,取1%磷钨酸溶液负染色10 mmin,取下铜网置于灯下烤十,透射电镜下观祭载药纳米粒的显微形态。在透射电镜下观察发现DANPs及PEG-DANPs颗粒大小均匀,形状接近规则的圆球形。4.高效液相色谱法和(HPLC)和高速离心法测定DANPs和PEG-DANPs的载药量和包封率DANPs及PEG-DANPs冻干剂加入适量的乙腈复溶,采用HPLC法测定DANPs及PEG-DANPs中的药物含量。DANPs的包封率为93.58±0.86%,载药量为8.71±0.98%;PEG-DANPs的包封率为95.4±5.5%,载药量为8.72±1.05%。5.药物体外释放实验评价三种药物及制剂的释放特点Aisu(?)、DANPs及PEG-DANPs分别配置成5 mg/mL的溶液,加入孔径为10kD的透析袋中,两端扎紧后将透析袋置于40 mLPBS缓冲液中恒温振荡。在一系列时间点取出样品0.2 mL透析液,同时补充0.2 mL透析液,在透析完成后将透析袋剪破,搅拌均匀,作为时间无穷大时的药物释放量。使用HPLC法测定浓度,分别绘制出三种体外药物释放曲线。根据所绘体外释放曲线所示,Aisu(?)在2小时时已经基本完全释放,而DANPs和PEG-DANPs两种制剂释放均比较平缓,无突释现象,反映出药物白蛋白纳米粒的稳定性以及释放的缓释性。另外,PEG-DANPs较DANPs的释放更加平缓,在血浆中的滞留时间更长,缓释效应更加突出。6.药物体外溶血实验评价三种药物及制剂对机体红细胞的破坏情况取新鲜豚鼠血除去纤维蛋白后,加0.9%生理盐水离心洗涤直至上清液不再显示红色为止,加入5%葡萄糖注射液配制成2%(v/v)的红细胞混悬液。取Aisu(?), DANPs以及PEG-DANPs制剂；另取同体积新鲜蒸馏水作为阳性对照组；取同体积5%葡萄糖注射液作为阴性对照组,向上述各管中分别加入同体积的2%红细胞混悬液,置37℃的水浴1h后取出试管以2000 rpm离心5 min,吸取上清液在576 nm处测定各管溶液的吸收度计算各试验管样品的溶血度值。结果显示,与Aisu(?)和DANPs进行比较,在不同浓度下,PEG-DANPs的溶血程度均有所下降,提示其对机体红细胞的破坏作用最小。7.三种药物及制剂体内药代动力学的研究12只健康雄性豚鼠随机分为3组,每组4只,分别尾静脉注射Aisu(?)、DANPs和PEG-DANPs (20mg/kg)。于特定时间点各取血0.5 mL,置于肝素化的离心管中,离心(4000 rpm,10min),分离血浆,放入-20℃冰箱避光保存,利用HPLC测定并计算药代动力学参数。结果显示,PEG-DANPs与Aisu(?)及DANPs组比较,在t 1/2、AUC、Cl均有显著性差异,说明PEG-DANPs较Aisu(?)及DANPs在体内循环时间更长,具有更长的生物半衰期和体内滞留时间。8.MTT法测定三种药物及制剂对A549细胞增殖抑制情况A549细胞培养至对数生长期,以8×103个/孔加入96孔板,培育24h后,分别加入PBS液(阴性对照组)、Aisu(?)、DANPs、PEG-DANPs,药物浓度依次为0μg/mL、 0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL,继续培养24h、48h及72h。吸弃旧培养基后加入20μL MTT液继续培养4小时,再加入二甲基亚砜(DMSO)溶液,低速振荡10 min,测定在490 nm处的吸光度值,记录结果,计算不同药物浓度下细胞增殖抑制率并轴绘制细胞生长曲线。结果显示,三种药物都对A549细胞表现出相同的浓度-时间依赖型细胞毒性。在高浓度(1-100μg/mL)时,Aisu(?)制剂比DANPs和PEG-DANP纳米粒制剂抑制癌细胞增殖的能力更强；而在正常和低浓度区间(0.001-0.1μg/mL)时,纳米粒制剂对于对于癌细胞增殖的抑制要高于Aisu(?)在72小时,Aisu(?)制剂由于在血液中已经几乎检查不到血药浓度,因此,对细胞的抑制率也几乎难以测出。9.流式细胞技术测定三种药物及制剂对A549细胞诱导凋亡的情况取对数生长期A549肿瘤细胞,以1×105个/瓶传代培养至4个25cm3培养瓶,培养生长至密度60%时加入对照组(空白培养基)、Aisu(?)、DANPs和PEG-DANPs进行干预,收集各组细胞,加Buffer结合液混匀,吹打均匀。室温避光操作,加FITC混匀后,再加PI,室温避光反应30min。立即上机检测。根据结果可知,随着对照组、Aisu(?)、DANPs和PEG-DANPs药物的不同,在48小时这个特定时间点上,右上象限(An+PI+)及右下象限(An+PI-)之和,即早凋、晚凋细胞和坏死细胞所占比例逐渐增多,分别为2.86%、25.85%、45.00%及50.65%,提示用药组比对照组均能更显著地诱导细胞凋亡,而在三者之间,PEG-DANPs较DANPs及Aisu(?)更能够诱导肺癌A549细胞的凋亡,即PEG-DANPs诱导细胞凋亡的能力是最强的。10.激光共聚焦显微镜观察DANPs和PEG-DANPs入胞情况收集对数生长期的A549细胞接种于铺有细胞爬片的6孔板内,培养24h待细胞贴壁生长后,加入已制备好的DANPs和PEG-DANPs,将6孔板置于培养箱中培养。在达到特定时间点时,用镊子将细胞爬片取出,用冷PBS缓冲溶液清洗3次后放在4%的多聚甲醛中固定。然后取出爬片倒置在载玻片上,用50%的甘油封片。在488 nm波长的激发光条件下,用共聚焦显微镜观察。香豆素6在488nm激光激发下显绿色荧光,比较它们之间的镜下情况,随着制剂的不同,荧光摄取强度也逐渐增大,结果显示PEG-DANPs比DANPs更容易进入A549细胞内。11.非小细胞肺癌移植瘤及原位癌模型建立并评价药物及制剂的抗瘤效率及毒性BALB/c裸鼠40只,20只用于建立皮下移植瘤模型,20只用于建立原位癌模型,均分为4组,待接种后13天(即皮下组肿瘤体积到达120 mm3时),两组给予葡萄糖注射液,Aisu(?)、DANPs和PEG-DANPs,均通过尾静脉注射(20mg/kg),每7天给药1次,共给药4次。在最后一次给药治疗2天后,将皮下移植瘤组和原位癌组所有裸鼠全部处死,取瘤块、肺脏、心脏、肝脏、脾脏、肾脏,以10%中性甲醛缓冲液固定,之后送检HE染色切片。根据裸鼠瘤块体积与药物治疗时间关系曲线我们发现,Aisu(?)、DANPs组和PEG-DANPs组三种制剂对肿瘤都具有一定的抑制作用,PEG-DANPs组对瘤块增殖的抑制作用最强。Aisu(?)组、DANPs组和PEG-DANPs组裸鼠的体重均有不同程度的下降,说明三种制剂对机体都有一定的系统毒性,但其中PEG-DANPs下降得最小,表明PEG-DANPs组对机体的毒性则最小。根据病理结果显示,PEG-DANPs能够更好地抑制移植瘤及原位癌,并且能够更加有效地抑制癌细胞的转移。12.观察经药物治疗后裸鼠生存率情况选取裸鼠32只,建立皮下移植瘤模型,分成阴性对照组(葡萄糖注射液组),阳性对照组(Aisu(?)), DANPs组和PEG-DANPs组,持续治疗裸鼠直至裸鼠自然死亡,观察经不同药物及制剂治疗后裸鼠的生存率,待全部裸鼠死亡后,统计并绘制裸鼠生存率曲线。结果显示,由PEG-DANPs治疗的裸鼠比其他组可以存活更长的时间。实验结论1.成功地构建了PEG化多西他赛白蛋白纳米粒；2. PEG-DANPs粒径合适,分布均匀稳定,载药量及包封率良好,具有明显的缓释效应,对机体红细胞有较低的破坏作用；3. PEG-DANPs能够更好地进入A549细胞,能够有效地抑制A549细胞的增殖并诱导其凋亡：4. PEG-DANPs能够有效地抑制非小细胞肺癌移植瘤及原位癌的生长并且对机体具有较小的毒性作用,能够有效地控制癌细胞的转移,能较明显地延长裸鼠的生存时间。