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目的：非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是严重威胁人类健康的一类癌症。近年来,靶向药物治疗成为NSCLC治疗的重要手段。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种酪氨酸激酶(tyrosine kinase, TK)受体,在肿瘤细胞增殖、迁移和分化过程中发挥重要作用。EGFR在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中过表达,过表达与其基因突变密切相关。EGFR基因突变存在于一部分NSCLC患者,以吉非替尼为代表的EGFR酪氨酸激酶抑制剂对这一部分患者具有良好的治疗效果。目前发现的突变位点多位于EGFR基因外显子19和21,多数研究关注单点突变,且多以细胞为研究模型,不能准确模拟在体环境。本研究首次建立EGFR蛋白L858R+V834L双突变位点的皮下移植瘤小鼠模型,并观察吉非替尼在这一模型中的治疗效应。方法：肿瘤标本来源于湖南省长沙市中南大学湘雅二医院手术患者,女性,54岁,中-低分化腺癌。基因分型确定其EGFR L858R+V834L双基因突变阳性。原代肿瘤组织被剪成1.0-1.5mm3大小。雌性SCID小鼠背部皮下选取四个点接种瘤块,每点两块,此为第一代荷瘤小鼠(P1)。当某一点的皮下移植瘤直径大于1cm时,处理小鼠,剥离肿瘤按上述方法接种第二批SCID小鼠(P2),并重复上述步骤进行肿瘤传代,建立第三代、第四代荷瘤小鼠。四代小鼠肿瘤组织以EGFR基因突变L858R特异性抗体,采用免疫组织化学法和免疫印迹方法检测EGFR表达。DNA从肿瘤组织获得经PCR后产物送测序。第三代小鼠接种后,当瘤体直径达4-5mm时,选取5只小鼠给予吉非替尼治疗2周,5只作为溶媒对照,每三天测量肿瘤大小,计算体积,判断吉非替尼疗效。结果：1.成功建立移植瘤模型,P1、P2、P3和P4小鼠移植瘤成功率分别为50%、50%、100%和87.5%。2.免疫组织化学和免疫印迹法确证,各代移植瘤EGFR L858R蛋白表达均呈阳性。3.基因测序显示,各代移植瘤EGFR基因21外显子均存在L858R+V834L双突变位点,确证其与原代肿瘤序列一致。4.吉非替尼治疗部分抑制L858R+V834L双突变移植瘤体的生长。结论：本实验首次成功构建EGFR基因L858R+V834L双突变位点的移植瘤小鼠模型,且基因型在传代过程中保持一致；该模型对吉非替尼治疗敏感,可作为NSCLC患者EGFR基因突变阳性靶向药物筛选的模型。目的：靶向治疗是非小细胞肺癌(NSCLC)的重要治疗手段,近年来陆续发现多种新的治疗靶点。ALK (Anaplastic lymphoma kinase,间变性淋巴瘤激酶)融合基因,特别是EML4-ALK融合基因是当前NSCLC靶向治疗的新研究热点。以Crizotinib为代表的ALK抑制剂在临床应用取得了较好的疗效,大多数ALK融合基因阳性的NSCLC病人对Crizotinib敏感,但最后不可避免地在一年之内因出现耐药而复发,部分机制不明,还有患者可有多重耐药出现,出现另一些激酶的活化如EGFR和其他酪氨酸激酶受体活性的增加,使得耐药的具体机制更为复杂。已知Akt和ERK等信号通路,特别Akt和ERK磷酸化水平与ALK调控细胞生存与凋亡密切相关,也参与了crizotinib耐药的发生。本研究将利用皮下移植瘤技术建立原代非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因小鼠,以此为模型,诱导crizotinib获得性耐药的发生,为寻找新型克服Crizotinib抵抗的ALK抑制剂,为临床ALK融合基因肺癌Crizotinib获得性耐药患者的治疗提供实验依据。方法：肿瘤标本来源于湖南省长沙市中南大学湘雅二医院手术患者,男性,40岁,左上肺腺癌,低分化。基因分型确定其EML4-ALK融合基因阳性。原代肿瘤组织被剪成1.0～1.5mm3大小。雌性SCID小鼠背部皮下选取四个点接种瘤块,每点两块,此为第一代荷瘤小鼠(P1)。当某一点的皮下移植瘤直径大于1cm时,处理小鼠,剥离肿瘤按上述方法接种第二批SCID小鼠(P2),并重复上述步骤进行肿瘤传代,建立第三代荷瘤小鼠。三代小鼠肿瘤组织以ALK特异性抗体,采用免疫组织化学法和免疫印迹方法检测ALK表达。RNA从肿瘤组织获得经RT-PCR后产物送测序。第三代小鼠接种后,当瘤体直径达8-9mm时,选取6只小鼠给予Crizotinib治疗2周,6只作为溶媒对照,每三天测量肿瘤大小,计算体积,判断crizotinib疗效。另有耐药组10只持续给药6个月诱导耐药形成,提取肿瘤组织蛋白检测相关蛋白磷酸化水平的变化。结果：1.成功建立移植瘤模型,P1、P2和P3小鼠移植瘤成功率分别为50%、100%、和86.7%。2.免疫组织化学和免疫印迹法确证,各代移植瘤EML4-ALK融合蛋白表达均呈阳性。3.基因测序显示,各代移植瘤EML4-ALK融合基因表达呈阳性。4. Crizotinib治疗2周显著抑制EML4-ALK融合基因移植瘤体的生长。5. Crizotinib治疗6月产生获得性耐药,耐药肿瘤组织Akt和ERK磷酸化水平升高。结论：本实验成功构建非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因的移植瘤小鼠模型,且基因型在传代过程中保持一致；该模型对Crizotinib敏感并可诱导耐药的产生,可作为Crizotinib耐药性研究的模型。