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本研究旨在探索骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,b MSCs)来源的外泌体(Exosome,Exo)对创伤性颅脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)后神经炎症的影响及其可能的机制。首先通过体外实验,利用transwell共培养体系,研究b MSC及其外泌体对小胶质细胞样BV2细胞极化表型的影响;然后通过液压冲击装置制作小鼠创伤性颅脑损伤模型,通过尾静脉注射骨髓间充质干细胞外泌体,来验证外泌体在体内环境下对创伤性脑损伤后神经炎症和小胶质细胞极化状态的影响;进一步通过外泌体mi RNA测序及文献检索,筛选多种可能在这一过程中起决定作用的mi RNA及其可能的作用通路,通过TBI模型对相关mi RNA进行验证以确定目标mi RNA;最后使用工具病毒构建目标mi RNA抑制及过表达的基因小鼠,通过建立TBI小鼠模型,验证目的mi RNA及其相关通路在创伤性脑损伤后神经炎症过程中的作用。本论文的研究结果表明:b MSCs外泌体在体外和体内环境下均可促进小胶质细胞向抑炎(M2)表型极化,并抑制神经炎症反应。另外,b MSCs外泌体还可以减少神经元的凋亡,保护受损脑组织,其中mi R181b可能通过激活IL-10/STAT3通路而在这一过程中起主要作用。第一部分b MSCs及b MSCs外泌体在体外环境下对小胶质细胞样BV2细胞极化表型影响的研究目的:探究在体外培养条件下,b MSCs及来源于b MSCs的外泌体对激活状态BV2小胶质细胞细胞极化表型的影响,并探究其可能的机制。方法:静息状态下的BV2细胞接种于12孔的Transwell培养板里,每孔接种2.0*105个细胞,使用10%胎牛血清(FBS)和DMEM培养基培养,各孔均加入100ng/ml的脂多糖(LPS)刺激24h。然后将其分为3组,MG组(MG组),b MSCs和MG共培养组(b MSCs+MG组)以及b MSCs外泌体和MG共培养组(b MSCs-Exo+MG组)。MG组嵌套膜上室仅添加500ul 10%无外泌体血清和DMEM的混合溶液;b MSCs+MG组在嵌套膜上室接种5.0×104个b MSCs细胞,补足培养基(10%无外泌体血清+DMEM)至500ul;b MSCs-Exo+MG组在嵌套膜上室接种100ul提取的外泌体悬液,用上述培养基补足体积至500ul。更换Transwell板下室培养液(10%无外泌体血清+DMEM),放入细胞培养箱共培养48h。48h后取出Transwell共培养系统,收集各组细胞分别进行免疫荧光检测、流式细胞术检测以及RT-q PCR检测,观察BV2小胶质细胞M1/M2型状态及细胞比例、促炎因子和抗炎因子的表达水平。结果:免疫荧光结果显示,b MSCs+MG组和b MSCs-Exo+MG组中Arg1+细胞数目明显高于MG组。流式细胞术结果显示,b MSCs+MG组(9.39±1.91%)、和b MSCs-Exo+MG组(16.07±2.87%)中Q3区(Iba-1+/CD206+)细胞比例明显高于MG组(4.25±1.41%)(P<0.05),且b MSCs-Exo+MG组比b MSCs+MG组更高(P<0.05)。RT-q PCR结果显示,与MG组相比,b MSCs+MG组和b MSCs-Exo+MG组IL-1β、IL-6以及TNF-α的表达被抑制,而IL-10以及TGF-β的表达则增高,其相对表达量差异均有统计学意义(P<0.05);与b MSCs相比,b MSCs-Exo在炎症因子的表达量调控上作用更强(P<0.05)。结论:b MSCs和b MSCs外泌体均能促进激活的BV2小胶质细胞向抑炎表型(M2型)极化;b MSCs和b MSCs外泌体均能抑制促炎性细胞因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的表达,并促进抑炎性细胞因子IL-10以及TGF-β的表达,其中b MSCs外泌体的调控作用更强。第二部分b MSCs外泌体对TBI小鼠伤后神经炎症的影响及其机制探讨目的:观察b MSCs来源的外泌体在体内环境下对TBI小鼠伤后神经炎症、神经元凋亡等的影响,以及探索参与该过程的可能的mi RNA和相关通路方法:将健康的雄性C57BL/6小鼠(6-8W)分为4组,分别为假手术组(sham组,仅开骨窗,不造TBI模型)、脑外伤组(TBI组)、生理盐水组(TBI+Saline组)以及外泌体组(TBI+b MSCs-Exo组)。TBI造模后第1、第3以及第7天,每组各取部分小鼠处死取脑,存入-80℃冰箱用于后续检测,剩余小鼠在TBI后第7天全部处死,取脑组织制作切片。Nissl染色观察各组损伤区域面积,TUNEL染色观察损伤区域神经元凋亡情况,免疫荧光染色观察各组损伤区域Arg1的表达情况,Western Blot检测各组损伤区域脑组织Arg1、i NOS的表达情况,RT-q PCR检测各组促炎和抗炎因子等在TBI后1、3、7d的表达情况,并观察与神经炎症过程相关的主要通路蛋白的表达情况。根据外泌体mi RNA测序结果,结合文献复习,选定几种可能起作用的mi RNA,并通过q PCR对其进行验证。结果:Nissl染色结果显示,TBI+b MSCs-Exo组(0.509±0.177 mm2)的皮层损伤面积明显小于TBI组(0.697±0.39 mm2)和TBI+Saline组(0.709±0.196 mm2)(P<0.05)。TUNEL染色结果显示,TBI组、TBI+Saline组以及TBI+b MSCs-Exo组损伤区域均有不同程度的神经元凋亡,但是TBI+b MSCs-Exo组(22.2±3.03)的凋亡神经元数量明显低于TBI组(42.1±4.30)和TBI+Saline组(40.8±5.26)(P<0.05);免疫荧光染色显示,TBI组、TBI+Saline组以及TBI+b MSCs-Exo组均表达Arg1+细胞,但是TBI+bMSCs-Exo组Arg1+细胞比例更高(P<0.05);WB结果提示b MSCs外泌体组受损脑组织的Arg1含量高于TBI组和TBI+Saline组(P<0.05),同时其i NOS的含量相对较低(P<0.05);炎症因子检测结果表示,b MSCs外泌体注射可以抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表达(P<0.05),并抑制NFκB的激活(P<0.05),同时能促进IL-10和TGF-β的表达(P<0.05)并激活STAT3通路(P<0.05);另外,TBI小鼠注射b MSCs外泌体后,mi R181b在几个目标mi RNA中表达量相对较高。结论:b MSCs外泌体经尾静脉注射,可以作用于受损脑组织,减少皮层区的神经元凋亡,并且可促进小胶质细胞向抑炎表型(M2)转化和抑制神经炎症反应。其中,mi R181b可能通过影响IL-10/STAT3通路参与了这一调节过程第三部分mi R181b对TBI后神经炎症的影响及机制研究目的:探究mi R181b对TBI后对神经炎症反应的影响和作用机制。方法:构建mi R181b上调和mi R181b抑制慢病毒,利用脑立体定位仪定向注射入小鼠脑右侧顶叶皮层,构建mi181b脑组织特异性上调及抑制的小鼠模型。将小鼠分为3组,TBI组(普通小鼠,常规造TBI模型)、TBI-up组(mi R181b上调小鼠造TBI模型)以及TBI-down组(mi R181b抑制小鼠造TBI模型),然后利用液压损伤仪制作TBI模型。造模后第1、3、7天各组选择部分小鼠处死取脑,保存在-80℃冰箱用于后续检测,剩余小鼠在TBI后第7天全部处死,取脑组织制作切片。TUNEL染色观察损伤区域神经元凋亡情况,Western Blot检测各组损伤区域脑组织Arg1、i NOS以及STAT3在TBI后第7天时的表达情况,RT-q PCR检测各组促炎和抗炎因子等在TBI后1、3、7d的表达情况。结果:TBI-up组在TBI后第7天,脑损伤区域TUNEL阳性细胞数(24.8±1.94)明显小于其他两组,差异具有统计学意义(P<0.05);TBI-up组在TBI后第7天Arg1和STAT3的表达量明显高于TBI组和TBI-down组,i NOS表达量低于其他两组,差异均有统计学意义(P<0.05);TBI-up组的IL-10和TGF-β的表达量在TBI后持续升高,在TBI后第1、第3、第7天时均高于其他两组,IL-1β在TBI后第1、第3、第7天时低于其他两组,TNF-α在TBI后第3、第7天时低于其他两组,差异均具有统计学意义(P<0.05);各组在各个时间点IL-6的表达量差异没有统计学意义(P>0.05)。结论:过表达mi R181b可以有效减少TBI后的神经元凋亡,并能减轻神经炎症反应,促进小胶质细胞向抑炎表型(M2)转化;mi R181b这些作用的发挥是通过激活IL-10/STAT3通路实现的。