【摘 要】
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次级代谢产物作为抗生素、免疫抑制剂等可在医疗领域发挥重要价值。随着细菌耐药性的增加和超级细菌的出现,寻找新的抗菌物质成为许多科研工作者共同关心的课题。黑曲霉模式菌株CBS513.88的基因组测序结果显示该菌株拥有81个次级代谢基因簇,表明黑曲霉具有合成多种次级代谢产物的潜力。然而,目前有关曲霉次级代谢产物的报道很少,主要原因是实验室条件下次级代谢合成基因簇一般处于沉默状态,因此需要寻找不同方法激活
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次级代谢产物作为抗生素、免疫抑制剂等可在医疗领域发挥重要价值。随着细菌耐药性的增加和超级细菌的出现,寻找新的抗菌物质成为许多科研工作者共同关心的课题。黑曲霉模式菌株CBS513.88的基因组测序结果显示该菌株拥有81个次级代谢基因簇,表明黑曲霉具有合成多种次级代谢产物的潜力。然而,目前有关曲霉次级代谢产物的报道很少,主要原因是实验室条件下次级代谢合成基因簇一般处于沉默状态,因此需要寻找不同方法激活沉默基因的表达。本论文以黑曲霉FGSC A1279为研究对象,研究组蛋白乙酰化和去乙酰化修饰对次级代谢的影响,并利用CRISPR/d Cas9技术实现对次级代谢基因的定点表观调控。具体内容和结果如下:（1）对黑曲霉FGSC A1279、Δgcn E和gcn E-com（回补）菌株的粗提取代谢产物通过LC-MS分析,鉴定到11种已知化合物。通过半制备HPLC纯化到6种化合物,其中1种化合物未被报道过,将其命名为nigerpyrone,5种是已报道过的物质。使用高分辨率电喷雾质谱（HR-ESIMS）和1D/2D核磁共振（NMR）对6种物质进行分析,确定其化合物结构式,并预测了化合物Funalenone（4）、Fumonisin B2/B4、Isokotanin-A的生物合成基因簇。通过基因敲除确定了物质nigerpyrone（1）、carbonarone A（2）、pestalamide A（3）的合成基因簇,并提出了3个物质的生物合成模型。（2）利用同源重组方式对黑曲霉FGSC A1279的8个组蛋白去乙酰化酶基因分别敲除,成功获得7个敲除株。将7个缺陷菌株和原始菌株在不同培养基上培养,分析渗透压、温度、氧化胁迫以及化学药物对突变菌株的影响,发现hos A缺失对表型影响显著。此外,对Δhos A和Δhda A菌株进行了转录组分析,差异基因的GO功能注释表明hos A和hda A敲除抑制次级代谢产物、色素及细胞壁形成。利用LC-MS检测次级代谢产物变化,结果显示敲除hos A或hda A后Fumonisin B1/B2合成量减少80%以上。（3）利用ATAC-seq技术研究gcn E和hos A基因缺失对黑曲霉FGSC A1279染色质开放性的影响,结果表明与黑曲霉FGSC A1279相比Δgcn E和Δhos A菌株各存在约一千个特异性的染色质开放区域,说明基因gcn E和hos A的敲除会影响染色质开放性。开放性区域主要集中在转录起始位点（transcription start site,TSS）附近,90%以上的peaks集中在ATG上游1 kb范围内。差异基因GO功能注释表明gcn E和hos A缺失主要影响转录调控。结合RNA-seq和IGV可视化研究次级代谢基因染色质开放性与转录水平之间的关系,结果表明染色质开放程度增加不代表转录水平会提高。（4）利用CRISPR/d Cas9将人源组蛋白乙酰化酶p300定位到基因bre F启动子位置,成功将bre F基因的转录水平提高2-3.5倍,且激活效率和sg RNA的位置有关;p300-d Cas9可以提高黑曲霉FGSC A1279伏马毒素基因fuml的转录,并最终使Fumonisin B2合成量提高12倍。还研究了黑曲霉自身来源的表观修饰酶对bre F基因转录的影响,组蛋白乙酰化酶Gcn E和组蛋白去乙酰化酶Rpd A、Hos A对bre F转录起到抑制效果,组蛋白去甲基化酶Lde对其转录没有显著影响。Hos A-d Cas9可以显著提高色素基因fwn A的转录水平,使色素合成量增加。
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