【摘 要】
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黄鳝（Monopterus Albus）是一种典型的雌雄同体鱼,在自然环境条件下,先成熟为雌性,产卵后开始性转化,大约三年,会出现雄性个体。目前,黄鳝性逆转的现象一直是鱼类性别分化和性别决定研究热点问题,研究学者在组织学、细胞生理学和分子生物学等学科做出了大量的研究。但基于鱼类性别分化的方式多种多样,对黄鳝性逆转的研究知之甚少,黄鳝性逆转的机制也不是很清楚。对于雌雄同体的性逆转的鱼类而言,Dmrt
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黄鳝（Monopterus Albus）是一种典型的雌雄同体鱼,在自然环境条件下,先成熟为雌性,产卵后开始性转化,大约三年,会出现雄性个体。目前,黄鳝性逆转的现象一直是鱼类性别分化和性别决定研究热点问题,研究学者在组织学、细胞生理学和分子生物学等学科做出了大量的研究。但基于鱼类性别分化的方式多种多样,对黄鳝性逆转的研究知之甚少,黄鳝性逆转的机制也不是很清楚。对于雌雄同体的性逆转的鱼类而言,Dmrt1基因在性别分化方面起着关键作用,目前对于鱼类Dmrt1基因的调节机制尚不清楚。此外,外源性激素也是影响鱼类的性别决定和分化的重要因素,关于孕激素在黄鳝性别分化过程中的作用及相关基因启动子孕激素反应元件作用机制很少有人报道。为对黄鳝性逆转机制深入研究,本研究在实验室前期所克隆的黄鳝Dmrt1基因启动子的部分序列基础上,再次扩增出黄鳝完整的Dmrt1启动子序列,并预测了该启动子上重要的转录因子反应元件结合位点;成功构建了黄鳝Dmrt1基因启动子基因表达载体,同时研究孕激素对该启动子的活性影响;利用定点突变实验技术,对其启动子上孕激素反应元件（其保守序列为:ATGTTTTACC）进行定点突变。本文明确了孕激素对Dmrt1基因启动子上的调控活性,为深入研究其在性别决定与分化中细胞通路之间的转录调控机制奠定基础。1、Dmrt1基因启动子序列分析本实验室利用已获得的Dmrt1基因启动子进一步扩增,以黄鳝全基因组DNA为模板,得到全长为1519 bp的Dmrt1基因启动子序列,利用TESS-Transcription Element Search System转录因子结合位点在线预测数据库对黄鳝Dmrt1基因启动子序列进行预测分析,结果显示该序列存在AP-1、Oct-1、C/EBPa、GATAx等真核生物通用的转录因子结合位点以及与性别相关基因的蛋白结合位点如SRY、Sox3、Sox5,PR、ER等。2、启动子报告载体及孕激素表达载体的构建基因表达载体的构建是本研究最重要的一个步骤,本研究通过将目的序列与载体通过DNA连接酶连接形成一个整体,成功构建了Dmrt1基因启动子重组质粒和孕激素应答元件（Progestogen response element,PRE）位点突变后的Mut-Dmrt1基因启动子重组质粒,此外,成功构建了孕激素受体表达载体。这为后续载体携带目的序列进入受体细胞奠定坚实的基础。3、激素的测定利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法,检测黄鳝血清中双羟孕酮（DHP）、三羟孕酮（20β-S）、睾酮（T）和11-酮睾酮（11-KT）4种激素的浓度。在本文中血清样本的前处理方法用到蛋白去除和衍生化两个方法,并将这两种前处理方法进行对比分析,实验结果中可以看出蛋白去除该方法具有操作简单、灵敏度高、稳定性好等优点,可为黄鳝血清中的孕激素和雄激素检测提供科学准确的方法。样品检测结果显示在黄鳝血清中存在孕激素DHP（2H-P）和20β-S（3H-P）以及雄激素T和11-KT激素。4、双荧光素酶报告基因检测分析利用双荧光素酶检测系统,将构建的重组质粒经双酶切及测序鉴定,和孕激素受体表达载体一起转染至HEK-293T细胞,24h-48h后通过双荧光素酶报告基因载体检测黄鳝Dmrt1基因启动子的表达活性,并用不同浓度的孕激素刺激Dmrt1基因启动子及孕激素反应元件突变后的Dmrt1基因启动子。实验结果表明Dmrt1基因启动子序列具有荧光素酶活性,跟空载体相比,有明显的统计学意义;Mut-Dmrt1基因启动子与空载体相比仍有荧光素酶活性;与Dmrt1基因启动子的活性相比,突变了该启动子上PRE元件时,启动子活性下降较为明显,这表明PRE这个调控位点在Dmrt1基因启动子调控上起重要作用。此外,当孕激素浓度范围在10-11-10-7M时,高浓度的孕激素可以上调Dmrt1基因启动子的活性,而对PRE位点突变后的Mut-Dmrt1基因启动子的表达活性无影响。
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