基于靶向代谢和肠道菌群研究柴氏逍遥散治疗乳腺癌相关抑郁的作用机制

来源 :浙江中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ganyi
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目的:通过肠道菌群及血浆氨基酸-脑神经递质代谢探索柴氏逍遥散改善乳腺癌相关抑郁的作用及机制。方法:第一部分,通过查阅文献,分析血氨基酸-脑神经递质代谢、肠道菌群与乳腺癌、抑郁的相关性;结合中医传统理论和柴师临床研究经验,总结柴氏逍遥散治疗乳腺癌相关抑郁“疏肝”和“健脾”的代表性治则治法;论证基于血氨基酸-脑神经递质代谢和肠道菌群变化理论,研究柴氏逍遥散治疗乳腺癌相关抑郁的合理性。第二部分,采用Balb/c雌性小鼠作为实验动物,使用慢性不可预知温和应激和慢性束缚应激相结合的方法进行抑郁造模,通过行为学实验对造模是否成功进行检验。随后将小鼠重新随机分组,进行肿瘤抑郁造模及柴氏逍遥散干预,通过行为学测试(糖水偏好实验、悬尾试验、强迫游泳实验)、肿瘤病理和Tunel荧光染色等观察柴氏逍遥散对乳腺癌相关抑郁模型的干预作用。第三部分,取小鼠脑组织和血浆,利用高分辨质谱对脑神经递质和血浆氨基酸进行靶向代谢组分析,揭示柴氏逍遥散对脑神经递质代谢和血浆氨基酸的影响。第四部分,基于16S rDNA扩增子测序技术进行肠道菌群分析,分析各组肠道菌群物种的丰度、多样性和菌群差异,寻找柴氏逍遥散作用的肠道菌群靶点和脑神经递质、血浆氨基酸的关系。结果:第一部分,抑郁-脑神经递质-血氨基酸-肿瘤之间存在相关性,肠道菌群的变化会对神经递质、氨基酸代谢产生影响进而影响抑郁和肿瘤。柴氏逍遥散根据乳腺癌相关抑郁的临床特点和“疏肝解郁,健脾益气”的治法,对传统逍遥散进行了创新,在原方的基础上添郁金以理气,增疏肝之效;添太子参以益气,半夏以化痰,增健脾之功。第二部分,1.肿瘤抑郁造模(CD)组相较空白(NC)组在行为学方面,糖水偏好指数下降、悬尾试验不动时间上升、强迫游泳实验不动时间上升,抑郁行为增加,快感缺失和无助感表现增多;同时,脑海马体C1区细胞排列紊乱、数量减少和萎缩,部分神经细胞凋亡,提示脑结构受到损伤;在肿瘤方面,相较与单纯肿瘤组(CA),肿瘤体积增大,瘤体增加,肿瘤生长速度更快,Ki67阳性染色增加,甚至部分小鼠出现肺转移,提示肿瘤抑郁造模促进肿瘤生长和转移。2.低、中剂量柴氏逍遥散干预肿瘤抑郁模型组(柴氏逍遥散干预组,CDL、CDM)相较肿瘤抑郁模型组,行为学方面,糖水偏好指数上升、悬尾试验不动时间减少、强迫游泳实验不动时间减少,抑郁行为减少,快感缺失和无助感表现减少;脑海马C1区细胞神经细胞排列较为规则,神经元数目较多,神经细胞凋亡减少,提示脑结构更趋于正常;在肿瘤方面,柴氏逍遥干预组肿瘤体积更小,肿瘤生长速度减缓,Ki67阳性染色减少,提示柴氏逍遥散能抑制肿瘤生长。第三部分,1.肿瘤组相较空白组,脑神经递质高香草酸上升差异显著,其余脑神经递质均下降;肿瘤组绝大多数血浆氨基酸均上升;Pearson相关性分析显示:肿瘤组血浆氨基酸与脑神经递质的相关性减弱或呈现负相关,血浆氨基酸之间相关性增加。2.肿瘤抑郁模型组相较空白组和肿瘤组,脑神经递质均下降,其中L-谷氨酰胺,多巴胺下降具有显著差异;血浆氨基酸L-酪氨酸,色氨酸等相对下降,其余氨基酸均上升,β-丙氨酸、L-肌氨酸上升差异显著;Pearson相关性分析显示:肿瘤抑郁模型组血浆氨基酸与脑神经递质代谢相关性改变,血浆氨基酸之间正相关增加,脑神经递质之间相关性进一步减弱。3.柴氏逍遥散干预组相较肿瘤抑郁模型组所有脑神经递质均上升;血浆氨基酸L-鸟氨酸,β-丙氨酸,L-苏氨酸,L-脯氨酸,L-蛋氨酸,L-缬氨酸,β-氨基异丁酸,L-亮氨酸下降差异显著;Pearson相关性分析显示:血浆氨基酸与脑神经递质代谢相关性增加,血浆氨基酸之间相关性减弱或呈现负相关,脑神经递质之间相关性增加。第四部分,1.肠道菌群α多样性和β多样性结果显示:各组间各组物种丰度和多样性无显著差异。菌群PCoA和PLS-DA聚类分析发现:肿瘤抑郁模型组和柴氏逍遥散干预组与空白和肿瘤组均能显著区分,ADONIS分析(Pr=0.001,Pr<0.05有统计学显著性)和Anosim分析(P=0.001,P<0.05有统计学显著性),明确了分组差异具有统计学显著性。2.组间差异菌群分析显示:肿瘤抑郁模型组主要为 Firmicutes(厚壁菌门),Clostridia(梭菌纲),Lachnospirales(毛螺菌目),Acholeplasmatales(无胆甾原体目),Prevotellaceae(普雷沃氏菌科),Rikenellaceae(理研菌科),Lachnospiraceae(毛螺菌科),Eggerthellaceae 科,Alistipes(另枝菌属),Enterorhabdus(肠杆菌属),Anaeroplasma(厌氧小体属)等显著上升,Bacteroidota(拟杆菌门)等显著下降。3.柴氏逍遥散干预组差异菌群主要为Coriobacteriia(红蝽菌纲),Erysipelotrichales 目,Acholeplasmatales(无胆甾原体目),Rikenellaceae(理研菌科),Enterorhabdus(肠杆菌属),Alistipes(另枝菌属),Anaeroplasma(厌氧小体属)等显著下降,Bacteroidescaecimuris(盲肠类杆菌)显著上升。4.Spearman相关性分析显示,柴氏逍遥散作用的肠道菌群,与部分脑神经递质的上调有关(尤其是色氨酸、酪氨酸、犬尿氨酸、多巴胺,去甲肾上腺素、组胺、组氨酸),与部分血浆氨基酸下调有关。结论:第一部分,文献研究发现肠道菌群和代谢改变与乳腺癌相关抑郁密切相关,柴氏逍遥散“疏肝解郁,健脾益气”,通过肠道菌群和代谢改善整体的病理状态。第二部分,成功建立了乳腺癌相关抑郁模型,该模型有明显的的抑郁行为和脑病理损伤,并且促进了肿瘤生长和转移。柴氏逍遥散干预后,抑郁行为和脑病理损伤改善,同时抑制了肿瘤生长和转移。第三部分,柴氏逍遥散可改变酪氨酸、色氨酸下游通路异常,提高所有脑神经递质水平,影响血脑间氨基酸的转运、代谢,促进血芳香族氨基酸(酪氨酸、色氨酸)流入脑,改变血浆氨基酸代谢再分布,从而改变肿瘤物质、能量供给,改善抑郁症状,抑制肿瘤生长和转移。第四部分,肿瘤抑郁造模影响了肠道菌群结构,引起有害菌显著上升,厚壁细菌/拟杆菌比例增加,并且这些肠道菌群的改变影响了脑神经递质和血浆氨基酸的变化。柴氏逍遥散能下调有害菌群、下降厚壁菌门/拟杆菌比例,上调了有益菌,并与脑神经递质和血浆氨基酸相关。综上所述,柴氏逍遥散通过改变肠道菌群结构,减少有害菌,改善脑神经递质和氨基酸代谢,促进氨基酸血脑转运,进而改善抑郁症状,抑制肿瘤生长。
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