神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是具有自我更新、增殖以及分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞潜能的一种干细胞。NSCs自我更新、增殖和多向分化潜能的维持需要一定的微环境，在干细胞研究领域称之为干细胞微环境或者“stem cell niche”，包括支持干细胞的细胞组分和非细胞组分。不同干细胞有着不同的微环境，然而低氧却是诸多干细胞微环境的共有组分。研究发现，在中枢神经系统中，神经干细胞内环境中的氧浓度约为1～8％或更小，亦即，神经干细胞生存于相对低氧的微环境中。此外，研究发现体外NSCs在2.5-5％O2的培养环境下能显著促进体外NSCs的增殖活性。可见，低氧是维持NSCs增殖以及干性的必要条件。但是，迄今为止低氧促进NSCs增殖的作用机制尚未阐释清楚。　　自噬是溶酶体介导的一种细胞内降解途径，经典的自噬途径是具有双层膜的自噬隔离膜识别并包裹不需要或受损的蛋白质或细胞器形成自噬体，然后与溶酶体融合成自噬溶酶体并由溶酶体内的蛋白水解酶将其降解的过程。自噬被认为是细胞质量控制以及代谢调节的重要方式，在细胞应对如饥饿、低氧等外界刺激时发挥重要的适应性调节作用。最近研究表明，NSCs中的自噬活性明显高于终末分化细胞的自噬活性，并且在维持干细胞的干性中具有重要作用。因此，推测自噬可能在低氧调控NSCs的增殖中具有重要作用。　　低氧是诱导自噬发生的经典刺激之一，可以通过多条途径调控细胞自噬的发生。根据低氧的核心调控因子—低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor1，HIF-1)的参与与否，可分为:(1)HIF-1依赖途径和(2)HIF-1非依赖途径。(1)HIF-1是细胞感知氧浓度变化调控细胞适应环境的转录因子，可转录激活BNIP3或REDD1，从而参与自噬调控。BNIP3转录激活后释放出Beclin1，参与自噬起始;而REDD1转录激活后通过TSC1/TSC2-Rheb途径抑制mTOR活性从而诱导自噬;(2)HIF-1非依赖途径:低氧刺激激活AMPK，后者一方面可通过TSC1/TSC2-Rheb途径抑制mTOR活性而诱导自噬，另一方面可直接激活ULK1引起自噬的发生。因此，低氧诱导自噬是涉及多种分子的复杂信号转导通路。　　在本研究中，探讨了(1)3％O2低氧条件下NSCs增殖与自噬活性的关系;(2)低氧(3％O2)调控NSCs自噬的可能分子机制。在实验中，通过分离胚胎14.5天的大鼠中脑组织，体外分离培养NSCs，并以3％O2作为低氧模型，观察低氧下NSCs增殖与NSCs自噬活性变化的关系，并进一步阐明自噬在NSCs增殖中的作用及可能的调控机制。　　主要研究结果如下:　　1.自噬介导低氧下神经干细胞的增殖　　利用20％O2（常氧）和3％O2（低氧）两种氧浓度，分别观察常氧和低氧下NSCs的增殖情况以及NSCs中的自噬活性，并进一步通过用抑制剂干预自噬后检测NSCs的增殖变化，明确自噬在NSCs增殖中的作用。　　1.1低氧对NSCs增殖的影响　　通过直接测量NSCs神经球直径的大小和MTT检测NSCs的相对活性，观察常氧和低氧条件下(24h、48h、72h)NSCs增殖的动态变化。实验结果显示:低氧可显著促进NSCs的增殖，低氧条件下神经球(neurosphere)的数量显著增多，直径明显增大。　　1.2低氧促进NSCs的自噬活性　　通过Western Blot检测了常氧和低氧经不同时间处理后NSCs自噬活性的变化。实验结果表明:低氧可明显促进NSCs的自噬活性，自噬标志分子LC3-Ⅱ的表达明显增加，并且在12-72h内，LC3-Ⅱ的表达与低氧时间呈现明显的时间-效应关系。此外，利用自噬阻断剂BafA1阻断自噬后，LC3-Ⅱ得到显著积累，并且其在低氧下的积累明显多于常氧情况下。　　1.3低氧下NSCs增殖与自噬活性的关系　　利用自噬抑制剂3-MA和自噬阻断剂BafA1分别抑制或阻断NSCs自噬后检测了NSCs的增殖情况。神经球的形态观察结果显示:抑制或阻断自噬后，神经球的数量和神经球的直径显著减少或减小。MTT和EdU的检测结果进一步证明:在低氧过程中抑制或阻断自噬后，NSCs的增殖明显受抑制。　　通过上述实验明确了低氧能促进NSCs的增殖，并且增强其自噬活性，而抑制或阻断自噬则消除了低氧对NSCs的促增殖作用。由此可以确定自噬介导了低氧下NCSs的增殖。　　2.低氧通过HIF-1-BNIP3-mTOR通路参与调节NSCs的自噬与增殖为了进一步明确低氧调控NSCs自噬活性进而促进NSCs增殖的分子机制，首先评价了低氧核心调控分子HIF-1对NSCs自噬以及增殖的影响。　　2.1HIF-1介导低氧下NSCs的自噬活性与增殖作用　　首先通过Western Blot检测了常氧和低氧条件下NSCs中HIF-1α表达的动态变化与NSCs增殖的关系。实验结果表明:低氧下HIF-1α的表达与自噬活性和核增殖抗原PCNA的表达呈正相关。进一步通过在常氧下过表达HIF-1α或使用PHD抑制剂FG-4592稳定激活HIF-1α，能显著增加NSCs中的自噬活性并诱导PCNA的高表达;相反，低氧条件下通过siRNA敲低HIF-1α后，NSCs中的自噬活性和PCNA表达均受到抑制。　　2.2HIF-1通过调节mTOR活性介导低氧下NSCs的自噬　　mTOR是自噬上游重要的负调控分子，发现NSCs经低氧不同时间处理后HIF-1α的表达与mTOR的活性呈负相关，即低氧下HIF-1α的表达逐渐增加而mTOR活性逐渐降低，而此时自噬分子LC3-Ⅱ的表达也逐渐增加。进一步通过siRNA敲低HIF-1α后，观察到NSCs中mTOR活性明显增加而自噬和增殖则受到抑制。此外，在常氧下过表达HIF-1α后mTOR及其底物p70S6K的活性被抑制，NSCs中LC3-Ⅱ和PCNA表达显著增加。上述结果表明，低氧可通过HIF-1-mTOR途径调节NSCs的自噬活性。　　2.3BNIP3介导HIF-1对mTOR的调节，进而参与低氧对NSCs自噬与增殖的调控　　据报道BNIP3作为HIF-1的靶基因，能通过调节Rheb抑制mTOR的活性，因此推测BNIP3可能参与低氧下HIF-1对mTOR的负调控。首先观察了低氧下BNIP3的动态表达变化，结果显示:与HIF-1α相一致，BNIP3的表达与mTOR的活性呈显著负相关。在常氧下过表达BNIP3则抑制了NSCs中mTOR及其底物p70S6K的活性，而LC3-Ⅱ和PCNA的表达呈明显增加;低氧条件下通过siRNA敲低BNIP3后mTOR及其底物p70S6K活性得到增强，LC3-Ⅱ和PCNA表达有所降低。　　综上所述:在本研究中发现并证实了自噬介导了低氧(3％O2)对NSCs的促增殖作用。重要的是，首次揭示了低氧通过HIF-1-BNIP3-mTOR通路激活自噬，调节NSCs增殖的新机制。该研究将为NSCs的体外扩增与临床应用提供新的思路。