论文部分内容阅读
目的:对化疗药物产生耐药性是绒癌治疗失败的主要原因之一。人肿瘤坏死因子（huTNF-a）基因的转导的确能在mRNA水平和蛋白水平逆转绒癌耐药细胞株的多药耐药基因（MDR1）,增加绒癌耐药细胞对细胞毒性药物的敏感性。全身应用TNF-a能引起严重的副反应,而且外源性TNF-a通过层层障碍到达肿瘤细胞后,真正与肿瘤细胞发生作用的很少。寻找理想的转基因的载体,将TNF-a带到肿瘤局部发挥作用,成为解决问题的关键。间充质干细胞（MSCs）具备成为转基因载体的很多优势,例如:分布广泛,易于获得,有很强的复制、扩增能力,更重要的是具有肿瘤趋化特性。本研究通过腺病毒介导huTNF-a基因转染人脐血间充质干细胞（huUCB-MSCs）,与绒癌耐药细胞株共培养后,观察耐药细胞株耐药指数的变化及huUCB-MSCs对肿瘤细胞的定向趋化能力。方法:利用人的脐带血分离、培养、纯化获得huUCB-MSCs,并鉴定之。构建携带huTNF-a基因的腺病毒载体Ad5-TNFa-IRES-EGFP,用之感染体外培养的huUCB-MSCs,酶联免疫吸附试验（Elisa）检测不同时间点转染细胞上清液中TNF-a浓度,采用细胞病变结晶紫染色法测定上清液中TNF-a的活性:用免疫印迹方法（Western Blot）及逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测huTNF-a基因在转染细胞中的表达。采用间歇诱导的方法成功建立绒癌耐药细胞株JEG-3/VP16并鉴定它的耐药性。将JEG3-VP16和携带huTNF-a基因的huUCB-MSCs共培养,MTT法测定共培养后JEG3-VP16耐药指数。应用穿孔试验法（transwell migrationassay）研究携带huTNF-a基因的huUCB-MSCs对JEG3-VP16的定向趋化及迁移能力。结果:来源于人脐带血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现类似成纤维细胞形态的间充质干细胞（MSCs）。该细胞表达MSCs的相关抗原CD29、CD44、CD90,但不表达造血干细胞的相关抗原CD34、CD45,这与源于骨髓的MSCs一致。对体外培养的MSCs进行成骨和成脂肪诱导后,多数细胞表现出成骨和成脂肪的能力。采用AdMax包装系统制备出以绿色荧光蛋白（EGFP）作为报告基因的腺病毒载体Ad5-TNFa-IRES-EGFP。测定病毒滴度为5.2×108PFU/ml。荧光显微镜观察到携带huTNF-a基因的腺病毒高效率感染huUCB-MSCs。RT-PCR检测到huUCB-MSCs中huTNFa的mRNA的表达,Western Blot没有检测到TNFa蛋白表达。ELISA结果显示转染后16h-48h内huUCB-MSCs上清液中的huTNFa浓度呈渐进上升的趋势,并可持续分泌到转染后10天。结晶紫染色法提示转染后上清液中TNFa有活性。成功诱导绒癌耐药细胞株JEG3-VP16并用MTT法鉴定其耐药性。JEG-3/VP16和转染huTNFa基因的huUCB-MSCs共培养后,MTT法测定jeg-3/vp16对VP16、5FU、MTX的IC50分别下降了12.8,6.75和10.1倍;而与未感染huTNFa的huUCB-MSCs共培养的jeg-3/vp16的IC50只分别下降了1.08,1.22和1.05倍。说明携带TNFa基因的huUCB-MSCs能逆转jeg-3/vp16的耐药性。穿孔实验结果显示JEG-3/VP16组的光密度值（0.39±0.03）显著高于空白对照组（0.11±0.08）及成纤维细胞组（0.10±0.05）,说明JEG-3/VP16组定向迁移的huUCB-MSCs数量明显多于成纤维细胞对照组和空白对照组,即huUCB-MSCs对肿瘤细胞有定向趋化迁移的能力。结论人脐血中含有丰富的MSCs足够满足体外实验需要。MSCs具有转基因载体的诸多优势,在本实验中成功扮演了huTNFa基因载体的角色。腺病毒介导的huTNFa基因转染huUCB-MSCs具有高效性。携带huTNFa基因的huUCB-MSCs与绒癌耐药细胞株JEG-3/VP16共培养后,逆转了JEG-3/VP16的耐药性,而且JEG-3/VP16对感染huTNFa基因的huUCB-MSCs有定向趋化作用。转基因间充质干细胞有望成为治疗绒癌耐药的一种新技术新途径。