目的:1.研究中国汉族人群中VEGF3’-UTR区936C→T基因突变状况。2.探究VEGF936C/T基因多态性和糖尿病视网膜病病变的相关性。研究对象与方法:(一)研究对象1、按照1999年WHO糖尿病诊断标准,选取2010年12月至2013年12月期间经泰山医学院附属医院确诊的2型糖尿病患者,共210例,其中,男112例,女98例,选取同期泰山医学院附属医院健康体检者120例,其中,男56例,女64例,选择对象均是中国汉族人,彼此间无任何血缘关系,无冠心病、脑梗死病史,无慢性心、肾功能不全病史,无慢性肺病史。2、病例分组1)健康对照组(NC):入选的120例均为OGTT正常的健康体检者,其中,男性55例,女性65例,平均年龄(59.64±8.94)岁。2)单纯2型糖尿病组(DM组):入选的52例患者中,男性28例,女性24例,平均年龄(61.53±10.42)岁,病程(61.53±10.42)年。3)非增殖性视网膜病变组(NPDR组):入选的78例患者中,男性38例,女性32例,平均年龄(60.86±11.38)岁,病程(9.67±4.61)年。4)增殖性视网膜病变组(PDR组):入选的80例患者中,男性42例,女性38例,平均(59.94±9.91)岁,病程(9.35±4.53)年。(二)研究方法1.临床资料采集、标本的留集、保存1)详细询问所有受试者的病史并体检,记录年龄、性别,测身高、体重、血压;测血压:坐位休息30分钟,用台式水银血压计测量右上臂的血压3次,取平均值。绝对空腹状况下准确测量身高、体重。体重指数(BMI)=体重(Kg)/身高(m)2。检查尿常规、腹部B超、心电图,行眼底检查或眼底造影,检测神经传导速度。2)采用葡萄糖氧化酶法(草酸钾氧化钠抗凝:2mg/m L血液)检测受试者的空腹及餐后2h血糖,低压液相层析柱法(EDTA抗凝全血,EDTA:血量=1.5mg/m L)检测Hb A1c,全自动生化分析仪检测血脂、肝、肾功,放射免疫法测定血浆胰岛素或C肽,应用电化学发光法测定尿AER;酶联免疫吸附测定法(enzyme 1inkedimmunosorbent assay,ELISA)检测血清中VECF水平(试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司),严格按照试剂盒说明书进行操作。2.将EDTA抗凝全血2ml(EDTA:血量=1.5mg/m L)分离去除血浆后保存于-20℃的冰箱中,用于抽提基因组DNA。3.采用聚合酶链反应—限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)来测定VEGF936C/T基因多态性。4.基因组DNA的提取、保存:取EDTA抗凝血100u L,采用试剂盒法提取外周血白细胞的DNA,用紫外分光光度法测定DNA的浓度、纯度,抽提后的基因组DNA用TE溶解后,于-80℃长期冻存。5.目的基因片段的扩增:用外周血白细胞的基因组DNA为模板来进行PCR扩增,50μl的反应体系中约含400ng的基因组DNA,上、下游引物各1.0u L(10Pmmol/ul),Taq DNA聚合酶2U,d NTP4ul(2.5mmol/u L),与Taq酶相对应的10хPCR Buffer 5μl,余用蒸馏水补足。在热循环仪上进行反应:95℃预变性5min后接着94℃变性30s,68℃退火30s后接着72℃延伸1min,重复进行30个循环后在72℃延伸10min。6.限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)检测:当凝胶电泳证实PCR扩增成功,就取PCR产物10μL,加入限制性内切酶NlaⅢ和相应酶解反应缓冲液在37℃孵3小时后,取酶切产物10μL行4%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观测基因型(C C型:208b P;C T型:208b P,122b P,86b P;T T型:122b P,86b P),摄片计数。7.统计学处理:采用SPSS13.0处理所有数据,以均数±标准差(x±s)表示正态分布资回归进行分析。结果:1.VEGF基因936C/T多态位点的检测结果C等位基因在未发生突变时为纯合型(C936C型),没有限制性内切酶NlaⅢ的酶切位点,琼脂糖凝胶电泳的结果只有1条208b P片段,等位基因T如是纯合型(T936T型),两条同源染色体上同时具有了限制性内切酶NlaⅢ的酶切位点,酶切后产生122b P和86b P 2条片断,而VEGF C936T杂合型(CT型)则同时具有3条片段,分别是208b P、122b P、86b P。(见图2,图3)。2.各组间VEGF基因型和等位基因频率比较NC组、DM组、NPDR组、PDR组都有C、T两种等位基因和CC、CT、TT三种基因型,分布特点符合hardy-weinberg平衡。各组的CC基因型频率分别是46.69%、50.02%、68.77%、69.53%,C等位基因频率分别是67.52%、64.50%、81.27%、81.73%。在NPDR组中,CC基因型和C等位基因频率明显高于NC组(χ2=9.934,χ2=4.899,P<0.01,P<0.05)及DM组(χ2=7.490,χ2=4.448,P<0.01,P<0.05);PDR组CC基因型和C等位基因频率明显高于健康对照组(χ2=10.895,χ2=5.714,P<0.01,P<0.05)及单纯糖尿病组(χ2=8.333,χ2=5.227,P<0.01,P<0.05);CT基因型于NC组、T2DM组、NPDR组、PDR组分布频率分别为:41.69%、36.98%、25.02%、24.41%,T等位基因频率分别是:32.52%、31.54%、18.77%、18.31%。NPDR组CT基因型和T等位基因频率明显低于NC组(χ2=6.486,χ2=4.899,P<0.05)和DM组(χ2=4.366,χ2=4.448,P<0.05);PDR组CT基因型频率和T等位基因频率低于NC组(χ2=7.327,χ2=5.714,P<0.01,P<0.05)及DM组(χ2=3.986,χ2=5.227,P<0.05)。进行TT基因型频率的组间比较时,因其突变率比较低,各组之间均没有明显统计学差异,于是参照Peter Kripple⑸的统计分析法,将携带T等位基因的基因型(即CT基因型和TT基因型)归为一组进行分析(简称为CT+TT型),其分布频率于NC组、DM组、NPDR组、PDR组分别是53.35%、50.02%、31.27%、30.51%,NPDR组的CT+TT型基因型频率明显低于NC组及DM组(χ2=9.934,χ2=7.490,P<0.01),PDR组CT+TT型基因型明显低于NC组及DM组(χ2=10.895和χ2=8.333,P<0.01)。然而各种基因型分布频率及等位基因分布频率在NC组、DM组之间,NPDR组、PDR组之间没有统计学差异(P>0.05)(见表1)。将不同基因型组间临床指标进行比较:对于DM患者而言,CC组、CT组、TT组三个不同基因型之间在性别构成比、年龄、病程、血压水平、BMI、Hb A1c、高密度脂蛋白(HDL-c)水平等方面没有统计学差异(P>0.05)。CC基因型和CT基因型、TT 基因型比较发现,:CC基因型在血糖水平、甘油三酯(TG)水平、总胆固醇(Total cholesterol,TC)水平、低密度脂蛋白水平(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和VEGF表达水平等方面明显升高,C肽水平明显降低(P<0.01,P<0.05)。DM患者CC基因型携带者VEGF的表达水平最高,TT基因携带者VEGF的表达水平最低(P<0.05)(见表2)。T2DM三个亚组之间的临床、生化指标比较DM组、NPDR组、PDR组之间在性别构成比、年龄、病程、血压、血脂、BMI及Hb A1c水平等方面无统计学差异(P>0.05),而单就C肽水平而言,NPDR组比DM组低,PDR组低于NPDR组和DM组(P<0.05)。4.不同基因型组之间的DR发生率比较在T2DM中,CC基因型组、CT基因型组、TT基因型组的DR发生率是70.91%、54.07%、45.47%。CC基因型组的DR发生率明显高于CT基因型组(χ2=6.615,P<0.05)及TT基因型组(χ2=13.875,P<0.01),而CT基因型组与TT基因型组相比,无统计学差异(χ2=1.620,P>0.05)。5.导致糖尿病视网膜病变发病的多重危险因素分析以有、无DR为因变量,以多元Logistic回归分析多因素对DR的影响,结果显示:VEGF基因多态性(即发生了C/T突变)与DR呈负相关(β=-1.027,OR=0.343,P=0.006,CI:0.157-0.723)。VEGF浓度、Hb A1c水平、LDL-C水平进入回归方程,OR值均大于1,为DR发病的危险因素。结论:1、VEGF 936C等位基因可能是中国汉族人2型糖尿病患者视网膜病变发病危险性遗传标志。2、VEGF936C/T基因多态性对糖尿病视网膜病变的发生、发展可能起着重要作用。3、VEGF 936T等位基因可能为减少糖尿病视网膜病变发病风险的保护性遗传标志。