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研究背景近年来,由于恶性肿瘤发病率越来越高,许多一线化疗药物的使用也越来越多,因此化疗所致神经病理性疼痛(Chemical therapy-induced neuropathic pain,CINP)的发病率也日趋增加。最新统计数据发现,30%-40%接受化疗的癌症患者会出现CINP,主要表现为四肢远端麻木,刺痛或闪痛,而且具有浓度依赖性。CINP严重影响化疗患者生存质量,极大地限制了一线化疗药物的使用。研究CINP的发病机制并提出有效合理的防治方法,对于改善恶性肿瘤患者生存质量和提高生存率有非常重要的价值。环磷腺苷效应元件结合蛋白(c AMP response element binding protein,CREB)是一种转录增强因子,能够刺激基因转录。最近的研究表明,CREB通过多种途径在急慢性疼痛调节中发挥重要作用。近年来,神经病理性疼痛中表观遗传调控机制备受重视,其中DNA甲基化修饰是重要研究热点,研究表明DNA甲基转移酶3a(DNAmethyltransferase,DNMT3a)在多种原因所致神经病理性疼痛的发生和发展过程中发挥重要作用。基因序列分析发现DNMT3a基因启动子序列中存在CREB的结合位点。CREB和DNMT3a是否在化疗所致神经病理性疼痛中发挥作用以及CREB是否转录调控DNMT3a,目前仍未有报道。研究目的研究CREB转录调控背根神经节(Dorsal root ganglia,DRG)中DNMT3a参与化疗引起的神经病理性疼痛的机制研究方法1.取8周大的CD1的小鼠,随机分为化疗组和对照组(n=10)。采用隔日腹腔注射PTX(0.4mg/kg,4次)的方法建立CINP模型,并测定小鼠机械痛阈值和热痛阈值。检测化疗所致神经病理性疼痛模型中CREB和磷酸化的CREB(Phosphorylated-CREB,P-CREB)和DNMT3a的表达情况。2.通过小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)基因沉默的原理,利用DRG显微注射方法干扰CREB的表达,观察小鼠机械缩足阈值、热缩足潜伏期、冷缩足潜伏期的变化。3.通过DRG显微注射CREB过表达腺病毒辅助病毒AVV5-CREB或对照AVV5-EGFP,检测过表达CREB对小鼠的疼痛相关行为学的影响,包括机械痛、热痛觉过敏、冷痛觉过敏和自发性疼痛。4.采用蛋白印迹法(Western Blot)检验下调或过表达CREB后DRG内P-CREB、CREB和DNMT3a蛋白含量的变化;通过免疫组织化学检测CREB与DNMT3a的共表达情况;通过染色质免疫共沉淀方法明确CREB结合DNMT3a基因启动子区,并进一步通过荧光素酶报告基因试验体外验证CREB对DNMT3a的转录激活作用。结果1.PTX注射后诱导小鼠产生了机械性触诱发痛和热痛觉过敏,从注射后6d开始,维持21天以上,并且在第14天行为变化最明显。Western Blot显示在CINP模型的小鼠DRG中CREB、p-CREB及DNMT3a蛋白表达显著增加,注射开始后第14天蛋白表达量最高,与行为学变化一致。2.在疼痛产生阶段,DRG显微注射CREB的小干扰RNA(si RNA)能够减轻PTX引起的CINP疼痛症状。在疼痛维持阶段,PTX注射后采用DRG显微注射si RNA的方法下调CREB的表达能够减轻化疗引起的痛敏症状。不影响动物的运动功能。可以说明,CREB在CINP的维持和发展过程中起作用。3.模仿化疗诱导的DRG内CREB的高表达能够诱导正常小鼠产生对机械痛、热痛觉过敏和冷痛觉过敏以及自发性疼痛的症状。不影响动物的运动功能。4.化疗能够引起DRG内p-CREB、CREB和DNMT3a的蛋白表达升高。抑制CREB的表达能够下调化疗引起的DNMT3a的高表达。模拟化疗引起的DRG内CREB的高表达能够引起DRG内DNMT3a的表达升高。5.CREB在PTX诱导的CINP中对DNMT3a的基因启动子区结合力增加,而且CREB能够与DNMT3a共表达于DRG细胞中。荧光色酶报告基因试验结果显示CREB能够显著转录激活DNMT3a。结论DRG内CREB通过转录激活DNMT3a,在化疗所致神经病理性疼痛的发生和维持过程发挥重要作用。