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鞘脂（sphingolipid）是细胞膜脂的重要成分,对于维持细胞膜正常的流动性起到重要作用。作为一种信号分子,鞘脂参与调节细胞的生长、分化、衰老和程序性死亡等许多重要的信号转导过程。神经酰胺（ceramide）是鞘脂代谢的中心产物,能传递凋亡和生长阻滞,可以被神经酰胺酶（ceramidase）水解生成鞘氨醇和脂肪酸。一氧化氮（nitric oxide,NO）是重要的信号分子,能调控植物多种生理过程,延缓果实衰老,缓解贮藏冷害。植物体内存在着NO和冷信号的交互作用。目前对于NO调控果实冷害的研究主要集中于NO对冷害的缓解效果和果实贮藏品质影响等方面,对于果实细胞膜脂如何感受冷藏期间的冷信号以及NO和冷信号交互作用对细胞膜脂组分和代谢的影响等方面研究较少。本实验以采后肥城桃为材料,提取果实总蛋白并进行同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）检测。结果显示,共检测到4776个蛋白质,涉及135个代谢过程。与外源NO处理相比,储存温度的不同更易引起蛋白质的表达差异。COG和GO分析发现,肥城桃果实采后贮藏期间,其主要的生理活动为蛋白质的代谢和糖分的积累。鞘脂代谢过程共检测到31个蛋白质,其中9个是差异蛋白。这些差异蛋白出现在鞘脂合成初期以及下游代谢过程,主要是β-半乳糖苷酶和丝氨酸棕榈酰转移酶,还包括中性神经酰胺酶、3-脱氢鞘氨醇还原酶等。根据iTRAQ结果,选择肥城桃神经酰胺酶(Prunus persica ceramidase,PPCDase)为后续研究的目标。采用同源克隆的方法和cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆获得了PPCDase基因全长。该全长为2784 bp,开放阅读框有2337bp,共编码778个氨基酸。NCBI网站blast结果和三维结构模拟表明,该基因即是桃中性神经酰胺酶基因,且与梅、梨的中性神经酰胺酶基因相似度较高。蛋白理化性质分析显示,PPCDase为亲水性蛋白,稳定性较强;二维结构模拟发现,PPCDase含有16段α螺旋和25段β折叠结构;亚硝基化预测表明,PPCDase内部有6个S-亚硝基化作用位点,具备发生亚硝基化的条件。根据PPCDase全长设计带酶切位点的引物,进行PPCDase重组蛋白的体外表达,并使用镍柱纯化法进行纯化。电泳结果显示,在112 KDa左右出现目的条带,重组蛋白表达和纯化成功。实时荧光定量PCR结果表明,外源NO处理能延缓PPCDase基因表达量的下降,冷藏效果更显著。