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目的：以小鼠糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白配体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-related protein ligand, mGITRL)作为共刺激分子在体外诱导Thl7细胞分化,研究参与该过程的信号分子,寻找其作用机制；建立小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)模型,并用mGITRL蛋白进行处理,研究GITR/GITRL通路下游信号分子对CIA发病的影响,寻找其可能的作用机制。方法：(1)免疫磁珠法分离小鼠脾脏来源的CD4+CD62L+初始型T细胞,以1×106/孔的浓度将初始型T细胞在Th17细胞不完全诱导体系中培养,体系中含有预包板的抗CD3 mAb (1μg/ml),游离的TGF-β(3ng/ml)、IL-6 (30ng/ml)、IL-23 (30ng/ml).抗IL-4 mAb (5μg/ml)以及抗IFN γmAb (5μg/ml),再将mGITRL蛋白(1μg/ml)以及对照蛋白(1μg/ml)分别加入体系中,72h后通过流式细胞术检测Th17细胞的比例变化。(2)在小鼠初始型CD4+T细胞培养孔中加入抗CD3 mAb以及mGITRL蛋白,37℃、5%C02培养72小时,然后再加入不同浓度的mGITRL蛋白(0、0.5、1.0、2.0μg/ml)作用20mins>或者加入1.0μg/ml mGITRL蛋白作用不同时间(0、20、40、60mins),通过Western-Blot检测胞内p38 MAPK磷酸化水平。将1nGITRL蛋白、mGITRL蛋白+SB203580 (p38 MAPK抑制剂,5μM)以及mGITRL+DMSO(SB203580的溶剂)分别加入小鼠Th17细胞不完全诱导体系中(体系成分同上),培养72h,通过流式细胞术检测Th17细胞的比例变化,收集细胞培养上清,通过ELISA检测上清中IL-17A的水平。在小鼠Th17细胞不完全诱导体系中,加入mGITRL蛋白以及不同浓度的SB203580 (0、2.5、5、7.5、10μM),检测Th17细胞的比例、IL-17和RORγt mRNA的表达水平,培养上清中IL-17A的水平变化情况。将mGITRL蛋白、mGITRL蛋白+SB203580以及mGITRL+DMSO分别加入小鼠Th17细胞不完全诱导体系中(体系成分同上)培养72h后,通过qRT-PCR检测IL-21mRNA的表达水平变化；收集细胞培养上清,ELISA法检测上清中IL-21的水平变化。(3)在小鼠初始型CD4+T细胞培养孔中加入抗CD3 mAb以及mGITRL蛋白,37℃、5%CO2培养72小时,再经过不同浓度的mGITRL (0、0.5、1.0、2.0μg/ml)刺激相同时间(20mins),或经过相同浓度(1.0μg/ml)的]mGITRL蛋白处理不同时间(0、20、40、60 mins),然后通过Western-Blot检测胞内STAT3 Tyr705以及Ser727位点磷酸化水平；用SB203580 (p38 MAPK抑制剂)预处理活化的初始型T细胞不同时间(30、60、90mins)之后,再经过mGITRL蛋白刺激,通过Western-Blot检测胞内STAT3 Tyr705以及Ser727位点磷酸化水平。将mGITRL蛋白、mGITRL蛋白+Stattic (STAT3抑制剂)以及mGITRL+DMSO (Stattic的溶剂)分别加入小鼠Th17细胞不完全诱导体系中(同前),在Th17细胞诱导条件下培养72h,收集细胞培养上清,ELISA法检测上清中细胞因子IL-17A以及IL-21的水平变化；收集培养结束的细胞,通过qRT-PCR检测IL-21mRNA的表达水平。(4)将牛Ⅱ型胶原(CⅡ)与等体积的弗氏完全佐剂1：1混合,充分研磨直至混合物完全乳化,取乳化物(100μg CⅡ/只)于小鼠尾根部皮内注射。初次免疫当日为第0天,于初次免疫后第21天用C II与弗氏不完全佐剂的乳化物加强免疫,诱导小鼠胶原诱导性关节炎(CIA)模型。将小鼠随机分成三组：CIA-GITRL组、CIA-GITRL-SB203580组以及CIA-GITRL-Carrier (SB203580的溶剂)组(每组6只),在初次免疫后第22天给予CIA-GITRL组小鼠连续5天进行尾静脉注射mGITRL蛋白(20μg mGITRL蛋白溶于100μlPBS缓冲液中)；在初次免疫后第20天给予CIA-GITRL-SB203580组小鼠尾静脉注射SB203580 (2.5mg/kg/天)直至第42天,在第22天开始给予该组小鼠连续5天尾静脉注射mGITRL蛋白(同上)；在初次免疫后第20天给予CIA-GITRL-Carrier组小鼠尾静脉注射p38 MAPK抑制剂的溶剂(200 μl/只/天,溶剂为含有1/100体积的DMSO的PBS缓冲液,其中DMSO作为助溶剂)直至第42天,在第22天开始给予该组小鼠连续5天尾静脉注射mGITRL蛋白(同上)。分别观察上述各组小鼠CIA发病进程(临床评分,CIA发病率,病理学检查等)；利用流式细胞术检测小鼠脾脏及局部淋巴结中Th17细胞的比例、数目变化；通过qRT-PCR检测脾脏CD4+T细胞中相关分子(IL-17、IL-21以及转录因子RORγt)的]mRNA表达水平；通过Western-Blot检测脾脏CD4+细胞内STAT3Tyr705以及Ser727磷酸化水平。结果：(1)在Th17细胞不完全诱导体系中,mGITRL蛋白处理孔中Th17细胞比例为27.22%,而对照蛋白处理孔为5.03%,显示mGITRL可明显促进Th17细胞的诱导分化。(2)当mGITRL为0.5或者1.0μg/ml时,经过上述处理的初始型T细胞中p38MAPK磷酸化水平升高；当1nGITRL刺激活化的初始型T细胞10或者20mins时p38 MAPK磷酸化水平升高。在Th17细胞不完全诱导体系中加入mGITRL蛋白,再加入p38 MAPK抑制剂SB203580后,Th17细胞的比例从22.19%下降到9.67%,培养上清中IL-17水平显著降低(mGITRL处理组：3192±210.7 pg/ml; mGITRL+SB203580处理组：432.7±14.94 pg/ml, p<0.001);在上述培养体系中加入不同浓度的SB203580培养结束后,体系中Th17细胞的比例、IL-17以及RORyt mRNA的表达水平、上清中IL-17A的浓度对SB203580表现出浓度依赖效应。在Th17细胞不完全诱导体系中,与对照蛋白处理组(534.2±52.71 pg/ml)相比,mGITRL蛋白处理组的培养上清中IL-21的水平明显上升(1036±299.3pg/ml) (p<0.01);在mGITRL蛋白处理组的基础上加入SB203580,其培养上清中IL-21的水平降低(716.6±66.81 pg/ml)。结果显示,在Th17诱导分化过程中,GITRL蛋白能够通过影响p38 MAPK的活性进而促进IL-21的产生。(3)当用浓度为1.0μg/ml mGITRL再次刺激经上述处理的初始型T细胞后,细胞中STAT3 Tyr705以及Ser727位点的磷酸化水平升高。当mGITRL刺激活化的初始型T细胞20或40 mins后,细胞内STAT3 Tyr705磷酸化水平升高,当mGITRL刺激活化的初始型T细胞10或20 mins时,P-STAT3 Ser727磷酸化水平升高。将上述处理的初始型T细胞用SB203580 (p38 MAPK抑制剂)预处理之后再经过mGITRL蛋白刺激,STAT3 Tyr705以及STAT3 Ser727位点的磷酸化水平降低。结果表明GITRL蛋白可通过p38 MAPK影响STAT3 Tyr705以及STAT3 Ser727位点的磷酸化水平。在Th17细胞不完全诱导体系中,与mGITRL蛋白处理组相比,mGITRL+Stattic(STAT3抑制剂)处理组上清中IL-17A水平明显降低(4195±191.7 pg/ml vs 1199±1273 pg/ml,p<0.05).在上述培养体系中,与mGITRL蛋白处理组相比,mGITRL蛋白+Stattic处理组培养上清的IL-21水平明显降低(1494 ±212.7 pg/ml vs 807.9±150.7 pg/ml,p<0.05).结果显示,在Th17细胞诱导分化过程中,GITRL蛋白能够通过调控STAT3分子促进IL-21的产生。(4)CIA-GITRL组小鼠在初次免疫后的第24天开始发病,在第36天达到高峰；而CIA-GITRL-SB203580组的小鼠在第30天开始发病,在第42天达到高峰。从不同处理组的模型小鼠CIA的发病率看出,在初次免疫后的第24天,CIA-GITRL以及CIA-GITRL-Carrier组中已经有33%的小鼠发病,CIA-GITRL-SB203580组小鼠的发病率为0%；在首次免疫后的第32天,CIA-GITRL组小鼠的发病率已经达到100%,CIA-GITRL-Carrier组小鼠发病率达到83.3%,而CIA-GITRL-SB203580组小鼠的发病率仅为33%,结果表明使用p38 MAPK抑制剂可有效减轻mGITRL对小鼠CIA发病的促进作用。和CIA-GITRL组(4.16±1.90%)相比,CIA-GITRL-SB203580小鼠脾脏中Th17细胞比例降低(2.21±0.39%,p<0.05)；CIA-GITRL-SB203580组小鼠(0.81±0.12%)局部淋巴结中Th17细胞比例低于CIA-GITRL组(1.81±1.18%,p<0.05)；同时,CIA-GITRL-SB203580组小鼠(1.79×104±0.69×104)局部淋巴结中Th17细胞的数目也明显低于CIA-GITRL组(8.7×104±6.9×104,p<0.05)。结果提示,p38 MAPK抑制剂减轻mGITRL对小鼠CIA发病的促进作用可能与体内Th17细胞的减少有关。结论：(1)mGITRL蛋白在体外能够促进初始型CD4+T细胞向Th17细胞分化,其作用与p38 MAPK发生磷酸化上调有关。(2)活化的初始型T细胞中,mGITRL蛋白能够通过p38 MAPK分子上调STAT3Tyr705以及STAT3 Ser727的磷酸化水平；p38 MAPK-STAT3途径在mGITRL蛋白促进Th17细胞诱导分化过程中影响IL-21的分泌。(3)在mGITRL蛋白处理的CIA小鼠模型中,p38 MAPK特异性抑制剂能够延缓并减轻CIA小鼠关节炎的发病,并且这种作用可能与Th17细胞的减少有关。