金黄色葡萄球菌(金葡菌)是一种分布非常广泛的食源性致病菌,可以对水产品、蔬菜以及肉制品等造成污染进而引发食物中毒,同时还可以引起多种人畜共患疾病,如化脓性肺炎、败血症和组织感染等,对公共卫生和安全造成极大的威胁。据报道,金葡菌可以分泌多种毒力蛋白,是其发挥致病性的主要原因,其中α-溶血素是最重要的毒力因子,可以破坏免疫系统而引起炎症反应,诱导单核巨噬细胞产生炎症因子并凋亡。同时金葡菌可以形成生物被膜,对生物被膜内部所包裹的细菌形成保护作用,降低其对抗生素和杀菌剂的敏感性,提高细菌的耐药性。肉叶芸香碱是从植物骆驼蓬种子中提取的天然物质,是一种三环的β-咔啉类生物碱,具有广谱的抑菌活性,尤其对链球菌显示了良好的抗菌效果。本文探讨了肉叶芸香碱对金葡菌生物被膜和α-溶血素的抑制作用并初步探讨了抑制机制,开展了以下4个方面的研究工作:(1)研究了肉叶芸香碱对金葡菌的抑菌活性。药敏性实验结果表明,肉叶芸香碱对金葡菌食品分离株的最小抑菌浓度范围为64~128μg/mL,对于金葡菌标准株ATCC 29213,最小抑菌浓度为128μg/mL。通过绘制不同时间和不同浓度的肉叶芸香碱作用下金葡菌的生长曲线,动态反映了肉叶芸香碱对金葡菌生长的抑制情况。此外,通过紫外吸收测定实验探讨了肉叶芸香碱对金葡菌标准菌株细胞膜的破坏作用。结果表明肉叶芸香碱可以造成金葡菌细胞膜破损,且呈现剂量依赖性,当作用浓度为128μg/mL,作用时间为1h时,内容物泄漏率高达73%。(2)研究了肉叶芸香碱对金葡菌生物被膜的抑制作用及其机制。肉叶芸香碱对金葡菌食品分离株生物被膜的最小抑制浓度范围为128~256μg/mL,对于金葡菌标准株ATCC 29213,最小抑制生物被膜生长的浓度为256μg/mL。通过结晶紫黏附实验和荧光显微镜观察,验证了肉叶芸香碱对金葡菌生物被膜具有抑制作用,结果呈现剂量依赖性。在此基础上,测定了生物被膜形成过程中的多糖胞间黏附素(PIA)和胞外DNA(eDNA)的释放量,结果表明肉叶芸香碱对二者均表现了抑制作用,且与浓度呈正相关,当浓度增加到128~256μg/mL时,PIA合成量减少了68%~74%左右,eDNA释放量减少大约75%左右。(3)研究了肉叶芸香碱对金葡菌α-溶血素的抑制作用。通过溶血活性实验,发现肉叶芸香碱可以抑制金葡菌上清液对兔血红细胞的溶血活性,且呈剂量依赖性,当肉叶芸香碱浓度为64μg/mL时,溶血能力急剧下降至对照组的32.54%。Western Blot实验证明,亚抑菌浓度的肉叶芸香碱可以对α-溶血素蛋白的表达产生抑制,且呈剂量依赖性。Real-time RT-PCR实验表明了肉叶芸香碱对α-溶血素基因的抑制作用,结果同样呈现剂量依赖性。(4)研究了肉叶芸香碱和金葡菌α-溶血素的分子对接情况。通过选取11个相邻的可能性高的聚合关键位点依次进行肉叶芸香碱与α-溶血素的分子对接计算。计算结果表明,肉叶芸香碱最有可能结合到α-溶血素N端转折处形成的巨大空穴,两端分别连接N端和β-三明治域,抑制α-溶血素自身产生形变和其他α-溶血素结合到该位点的能力,从而抑制α-溶血素七聚体的形成,降低其溶血活性。以上的实验数据阐明了肉叶芸香碱对金葡菌生物被膜和α-溶血素的抑制作用及机制,为肉叶芸香碱进一步被开发为天然高效的抗菌剂奠定了基础。