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目的:采用RNA干扰技术沉默3T3-L1脂肪细胞中围脂滴蛋白(PLIN1)基因的表达,观察对细胞中脂解的影响,并进行分子机制探讨,为肥胖症相关生物制剂的筛选与制备提供实验基础。方法:1.采用基因重组技术构建3组阳性sh-PLIN1干扰载体以及1组阴性载体,并通过菌液PCR法和DNA测序法对其进行鉴定。2.3T3-L1前脂肪细胞采用“鸡尾酒”法诱导分化,诱导成功后脂质体法转染细胞2d。3.细胞转染成功后,采用Bodipy 493/503染色脂滴,Hoechest 33258衬染细胞核;采用酶法检测细胞中甘油三酯(TG)及甘油的含量,评价细胞脂解情况。4.转染后的细胞通过Western blot法检测细胞中围脂滴蛋白A(PLIN1A)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)及其磷酸化蛋白(p-HSL)的表达;通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞中环磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)的浓度。另外,异丙肾上腺素(ISO)与sh-PLIN1干扰载体联合干预时,以浓度为10μM的ISO干预细胞6h。结果:1.随着细胞诱导分化的进行,3T3-L1前脂肪细胞体积增大,形态变圆,并出现脂滴。荧光染色后,脂滴呈“戒环样”围绕细胞核分布,且诱导分化第8d脂滴直径明显大于第4d。2.诱导分化第0d、4d和8d,细胞中TG含量呈上升趋势。3.3T3-L1脂肪细胞转染2d后,各组转染率均大于40%。与阴性转染组相比,3组阳性载体均能显著下调PLIN1A蛋白的表达(P<0.05)。4.转染sh-PLIN1干扰载体后,与阴性转染组相比,sh-PLIN1转染组细胞中脂滴减小,TG含量降低,甘油含量升高;ATGL和HSL表达量显著升高(P<0.05),p-HSL表达量及cAMP、PKA的浓度均无显著性差异(P>0.05)。5.ISO与sh-PLIN1干扰载体共同干预细胞后,与阴性转染组相比,ISO+sh-PLIN1转染组和sh-PLIN1转染组中ATGL表达量均显著升高(P<0.05),且2组之间无明显差异(P>0.05)。同时,ISO+sh-PLIN1转染组和ISO+阴性转染组中TG含量降低,甘油含量升高;HSL、p-HSL表达量及cAMP、PKA的浓度均显著升高(P<0.05),并且这些指标在2组中均无明显差异(P>0.05)。结论:1.sh-PLIN1干扰载体构建成功,并且可有效下调PLIN1A蛋白的表达。2.sh-PLIN1干扰载体可促进3T3-L1脂肪细胞脂解,其机制可能通过上调ATGL和HSL的表达而实现,而且cAMP/PKA信号通路对其无明显调节作用。3.ISO可通过激活cAMP/PKA信号通路,上调HSL和p-HSL的表达而发挥促脂解的作用,而sh-PLIN1干扰载体的促脂解作用可能并非通过cAMP/PKA信号通路介导。