恶性肿瘤是一类严重威胁人类生命和健康的疾病,据不完全统计,我国每年死于肿瘤的患者约130万人,全世界每年约700万人被肿瘤夺去了生命。手术、放疗、化疗仅能治愈45%左右的肿瘤,55%的肿瘤病人因晚期或高度恶性而无法治愈,肿瘤的预防和治疗已成为全球的医药工作者的重要使命,各国都投入了大量的人力和物力。肿瘤疫苗作为肿瘤生物治疗的一种重要手段,已成为抗肿瘤研究的热点之一,肿瘤疫苗通过接种引起细胞免疫和体液免疫反应,激发人体自身的天然抗肿瘤反应,达到防治肿瘤的目的,它适应了现代肿瘤治疗中强调的靶向性要求。在众多的肿瘤疫苗策略中,基因疫苗因其独特的优势,倍受人们的关注。基因疫苗是从基因治疗研究领域发展起来的一种全新疫苗,被誉为第三次疫苗革命,成为防治肿瘤的一个重要途径。恶性黑色素瘤可发生于皮肤、粘膜。发生于口腔粘膜的恶性黑色素瘤是口腔恶性肿瘤中恶性程度最高的肿瘤,常发生早期广泛转移,约70%转移至区域淋巴结,亦可转移至肺、肝、骨、脑等器官,远处转移率高达40%,预后极差。因此,开展恶性黑色素瘤肿瘤基因疫苗研究工作,无疑对于人类抗肿瘤具有十分重大的意义。本研究综合了目前国内外肿瘤疫苗设计的各自优势,将基因治疗、免疫治疗结合起来,设计了一种全新的广义上的基因疫苗,即构建以结核杆菌热休克蛋白70（mycobacterium tuberculosis heat shock protein70,mtHSP70）和人单纯疱疹病毒一胸苷激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-TK）基因为基础的双基因真核共表达DNA疫苗,利用减毒沙门菌对肿瘤的靶向性以之为载体,瘤内注射治疗实体黑色素瘤,其学术思想是以减毒沙门菌将mtHSP70/HSV-TK基因疫苗靶向传递至肿瘤细胞,予以HSV-TK前体药物更昔洛韦（Gancivol,GCV）,启动HSV-TK对肿瘤细胞的杀伤作用及旁观者杀瘤效应,死亡的肿瘤细胞与mtHSP70形成mtHSP70肽复合物,该复合物带有全肿瘤细胞抗原的指纹且mtHSP70为异种,其抗原性优于目前国内外DNA疫苗设计常用的以肿瘤某一特定抗原所构成的基因疫苗,利于打破目前存在的因DNA疫苗免疫原性不强形成的免疫耐受,达到抗肿瘤效应。[目的]:①构建结核杆菌热休克蛋白70（mtHSP70）和自杀基因单纯疱疹病毒一胸苷激酶（HSV-tk）双基因真核共表达质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK及实验对照组质粒PCMV-TK-IRES-EGFP和PCMV-mtHSP70-IRES-EGFP。②研究重组质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK与对照组质粒pCMV-TK-IRES-EGFP、pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP、PCMV-IRES-EGFP的体外表达及体外抗小鼠黑色素瘤细胞B16的效应。③构建SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-TK重组沙门菌及对照组SL7207/pCMV-TK-IRES-EGFP、SL7207/pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP、SL7207/pCMV-IRES-EGFP重组沙门菌及研究重组沙门菌体外的表达和对B16细胞的侵袭性。④确定重组沙门菌瘤内注射的剂量、时效性及治疗方案;研究重组沙门菌SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-TK瘤内注射抗小鼠B16肿瘤效应及机制。[方法]:①登陆genbank查询HSV-TK和mtHSP70基因mRNA序列,应用引物设计软件DNA club分别设计扩增HSV-TK和mtHSP 70基因全长cDNA的特异引物。以pcDNA3-TK质粒或mtHSP70质粒DNA为模板,分别采用各自的引物,用primeSTARHS DNA Polymerase进行PCR,获得HSV-TK和mtHSP 70基因cDNA片断,凝胶回收试剂盒回收得到1192bp（TK）和1898bp（mtHSP70）的目的基因片断,回收的DNA进行3‘加A反应,然后连接到T载体pMD 18-T上,转化大肠杆菌TG1后在Amp抗性平板上生长出约200个阳性菌落,每组随机挑选8个克隆接种到含500μlLB的2mlEP管中摇菌,用HSV-TK和mtHSP 70基因的特异引物进行菌落PCR,1.2%琼脂糖凝胶电泳结果显示HSV-TK连接产物转化的大肠杆菌8个菌落中有6个扩增出特定大小的PCR产物,证实为含有TK基因重组质粒的阳性菌落,而8个mtHSP70菌落中亦有6个获得长度为1898bp的片断,确定为含有阳性mtHSP70重组质粒。分别送检6个阳性pMD 18 T-TK重组质粒和pMD 18 T-mtHSP70重组质粒进行上、下游测序,测序结果与基因序列进行同源比较,各有2个重组质粒的序列与基因序列100%同源,而且引入的酶切位点序列也完全正确。各选定其中之一用于HSV-tk和mtHSP70基因的亚克隆。按照酶切体系,首先用限制性内切酶NotⅠ消化质粒pCMV-TK-IRES-CD和pMD 18 T-TK,电泳见特定酶切图谱。分别回收载体片断（约6200bp）和TK基因片断（1192bp）,载体片断经CIP处理后与回收的TK基因片断,在T4 DNA连接酶的作用下进行连接反应。连接产物转化大肠杆菌后铺kana抗性平板,挑选阳性克隆摇菌后少量提取质粒,PstI酶切,结果显示3号克隆的重组质粒酶切后获得1424bp和423bp酶切产物,证实TK在NotⅠ位点正向插入,少量提取TK正向插入的重组质粒pCMV-TK-IRES-TK,EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pCMV-TK-IRES-TK质粒和pMD 18 T-mtHSP70后电泳得到特定酶切图谱,回收6200bp和1898bp的片断,进行连接反应,以mtHSP70置换IRES上游的TK,构建质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK,所得阳性克隆摇菌后少量提取质粒,分别用NotⅠ单酶切及EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切进行酶切鉴定。同时并构建实验对照组质粒PCMV-TK-IRES-EGFP和PCMV-mtHSP70-IRES-EGFP,方法如下,用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ分别酶切pMD 18 T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒,pMD 18 T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒酶切经电泳见特定的酶切图谱,回收1192bp的TK基因片断和5300bp的载体片断并进行连接,将TK基因亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体IRES的上游,构建质粒PCMV-TK-IRES—EGFP,PCR产物电泳见1192bp的特异条带,少量提起质粒,SalⅠ和BamHⅠ酶切鉴定。用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ酶切pMD 18 T-mtHSP70和pCMV-IRES-EGFP,pMD 18 T-mtHSP70和pCMV-IRES-EGFP质粒酶切后电泳见特定的酶切图谱,回收1898bp的mtHSP70基因片断和5300bp的载体片断并进行连接,将mtHSP70基因亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体IRES的上游,构建质粒PCMV-mtHSP70-IRES-EGFP,PCR产物电泳见1898bp的特异条带,XhoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定。②24孔培养板传代培养细胞融合至50～70%时,依照Lipofectamine2000转染试剂盒操作说明进行转染,培养箱中继续培养24⁴8 h,荧光显微镜下观察转染效率。60 mm培养皿传代培养细胞融合至50⁷0%时,依照Lipofectamine2000转染试剂盒操作说明进行转染,分别用RT-PCR、Westernblot检测重组质粒mtHSP70/HSV-tk基因在B16细胞中mRNA及蛋白的表达。按2×10⁶细胞铺10 cm皿,待细胞80%融合后分别以LIPOFECTAMINE 2000转染质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK、PCMV-mtHSP70-IRES-EGFP、PCMV-TK-IRES-EGFP、PCMV-IRES-EGFP,转染后12小时铺96孔板,细胞进入指数生长期时加入药物更昔洛韦（GCV）行MTT检测TK基因体外对B16细胞的杀瘤效应。③制备沙门菌株SL7207感受态,分别将质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK,PCMV-IRES-EGFP,PCMV-mtHSP70-IRES-EGFP,PCMV-TK-IRES-EGFP电转入沙门菌SL7207,构建相应的重组沙门菌并酶切鉴定,将通过酶切鉴定的四个重组沙门菌分别接种于LB固体培养基反复传代培养20代后,抽提质粒,再行酶切鉴定减毒沙门菌SL7207携带质粒的稳定性。同时,每个重组菌感染B16细胞（细胞:细菌1∶50）,37度共孵育30分钟,用含庆大霉素（50mg/L）的无血清培养基洗涤细胞两次,杀死胞外菌。加入含胎牛血清（100ml/L）的RPMI1640培养基,37度孵育4小时,加入四环素至终质量浓度为10mg/L,继续培养至36小时。于荧光显微镜下观察荧光表达情况,拍照。收获经重组菌感染的B16细胞,行电镜观察和westernblot检测目的基因蛋白的表达。④以细胞浓度为10⁷/ml的小鼠黑色素瘤B16细胞0.1ml接种于C57BL/6J小鼠右背皮下建立小鼠黑色素肿瘤模型,病理切片确认为黑色素瘤,肿瘤体积达100mm³时分别以10⁷CFU/ml,10⁹CFU/ml,10¹¹CFU/ml三个浓度梯度的重组菌SL7207/PCMV-TK-IRES-EGFP注射于小鼠肿瘤内,每个浓度梯度注射小鼠3只,每只小鼠100ul,每日观察肿瘤局部是否有脓肿形成或破溃及小鼠的生活状态以确定的重组菌剂量。继而,建立小鼠黑色素瘤B16动物模型9只,以确定的重组菌剂量行瘤内注射一次,每只小鼠100ul。分别于注射后第二天,第四天,第七天各处死三只小鼠,取瘤,制作冰冻切片,荧光显微镜下观察作为报告基因的EGFP的表达情况以确定重组菌的时效性。确定重组菌瘤内注射的剂量和时效性后,以小鼠黑色素瘤细胞株B16细胞浓度为10⁷/ml,取C57BL/6J纯系小鼠60只（动物合格证号:NO:0041126）,于右背皮下注射100ulB16细胞悬液,建立荷B16肿瘤动物模型,以游标卡尺测量肿瘤大小,每隔三天1次,计算肿瘤体积按文献公式V=长×宽²×0.52,当肿瘤体积达到100mm³左右,随机进行实验分组:实验分为5组,每组12只荷瘤小鼠:实验组1:瘤内注射重组沙门菌SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-TK组（简记为HT组）。对照组1瘤内注射重组沙门菌SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-EGFP（简记为H组）对照组2:瘤内注射重组沙门菌SL7207/PCMV-TK-IRES-EGFP（简记为T组）对照组3:瘤内注射重组沙门菌SL7207/PCMV-IRES-EGFP（简记为Sa组）对照组4:瘤内注射PBS（简记为PBS组）实验组及对照组1.2.3以10⁹CFU/ml重组沙菌100ul分两点瘤内注射,对照组4予以100ul的PBS分两点瘤内注射,注射重组菌或PBS 1次,第二天予以GCV50mg/kg溶于0.5mlPBS腹腔注射,2次/天,连续5天,此为一疗程,连续治疗三个疗程。游标卡尺每隔三天测量各组肿瘤长短径1次。第三个疗程治疗结束时,根据所测的瘤体体积,计算各组抑瘤率,各组随机选5只荷瘤鼠每只鼠经眶取外周血0.6ml于抗凝管内行CD3+＼CD4+;CD3+＼CD8+的T淋巴细胞及NK细胞的流式细胞术;脱颈处死小鼠,取瘤称瘤重,计算各组抑瘤率,之后将每个瘤组织分为三份,-80℃保存备Elisa法检测肿瘤组织IFN-r;10%福尔马林固定肿瘤组织,石蜡包埋HE切片、免疫荧光检测瘤内的CD8+淋巴细胞分布及Tunel法检测瘤细胞凋亡;电镜前固定液固定瘤组织行电镜观察瘤细胞的改变,荷瘤小鼠的肝、肾、肺、胃及脾取下10%福尔马林固定,石蜡包埋HE切片做该疫苗的安全性分析;各组剩余荷瘤鼠观察生存期。[结果]:①构建的pCMV-mtHSP70-IRES-TK质粒分别用NotⅠ单酶切及EcoRⅠXhoⅠ双酶切进行酶切鉴定,酶切产物电泳见特异酶切图谱,确定为重组质粒pCMV-mtHSP70-IRES-TK;构建的pCMV-TK-IRES-EGFP以SalⅠ和BamHⅠ酶切见特异酶切图谱,确定为重组质粒pCMV-TK-IRES-EGFP。构建的pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP以XhoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定证实为mtHSP70重组质粒pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP。②含EGFP的重组质粒转染到B16细胞中,48 h后荧光显著增强了,细胞表达绿色荧光率约70%,细胞荧光分布于整个细胞。在以重组质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK转染的B16细胞的RT-PCR反应产物分别见与829bp和335bp大小的产物,分别与TK/mtHSP70引物大小一致;在以重组质粒PCMV-mtHSP70-IRES-EGFP转染的B16细胞的RT-PCR反应产物见335bp大小的产物,与mtHSP70引物大小一致;在以重组质粒PCMV-TK-IRES-EGFP转染的B16细胞的RT-PCR反应产物分829bp大小的产物,与TK引物大小一致。Westerblot结果显示转染pCMV-mtHSP70-IRES-TK质粒的B16细胞内有mtHSP70和HSV-tk蛋白表达,转染pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP质粒的B16细胞内有mtHSP70蛋白表达,转染pCMV-TK-IRES-EGFP质粒的B16细胞内有HSV-tk蛋白表达。MTT结果显示含TK基因的质粒在体外对B16细胞的杀瘤效应随GCV药物浓度增加而增加,重组质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK和PCMV-TK-IRES-EGFP在药物GCV浓度为50ug/ml时对B16细胞的体外杀瘤效应分别为50.45%,46.96%,两者在体外的杀瘤效应无统计学差别。③各重组沙门菌中抽提质粒,分别按相应的酶切体系进行酶切鉴定,酶切产物电泳均见特异酶切图谱,表明重组沙门菌构建成功。将通过酶切鉴定的四个重组沙门菌分别接种于LB固体培养基反复传代培养20代后抽提质粒,分别按相应的酶切体系进行酶切鉴定,结果与预期的一致,表明重组沙门菌携带质粒具备稳定性。重组菌感染B16细胞后,光镜下观察到B16细胞胞体变圆,荧光显微镜下观察到感染后36小时含EGFP的重组菌表达强的绿色荧光蛋白,表达率约为95%。电镜下观察均可见多个重组菌侵入B16肿瘤细胞的胞浆内,B16细胞发生肿胀。westernblot检测到各重组菌感染B16细胞后在B16细胞中分别表达相关目的基因的蛋白。④将细胞浓度为10⁷/ml的小鼠黑色素瘤B16细胞0.1ml接种于C57BL/6J小鼠右背皮下成功建立小鼠黑色素肿瘤模型,建模后3天可触摸到微小瘤结节,第5天成瘤明显,第7天肿瘤体积可达100mm³,成瘤率为100%。HE染色可见肿瘤组织多分叶,血管丰富,其间分泌有大量的黑色素颗粒。以10¹¹CFU/ml的重组沙门菌行瘤内注射100ul,次日小鼠精神稍痿糜,出现轻度腹泻,第三天肿瘤局部出现脓肿,第五天肿瘤出现坏死,两周后瘤体消失,但无小鼠死亡;10⁷CFU/ml和10⁹CFU/ml的重组沙门菌行瘤内注射100ul,小鼠的生存状态良好,无腹泻,肿瘤局部无脓肿坏死,为便于对治疗后的肿瘤微环境进行分析,因此,选择10⁹CFU/ml的重组沙门菌为治疗剂量。将瘤内注射重组菌的小鼠分别于注射后第二天,第四天,第七天各处死三只小鼠,取瘤,制作冰冻切片,荧光显微镜下观察作为报告基因的EGFP的表达,结果显示瘤内注射后第二天的肿瘤组织内可见作为报告基因的EGFP的表达,第四天的肿瘤组织内EGFP表达明显增强,第七的肿瘤组织内仍可见EGFP表达,但强度有所减弱。基于上述的实验结果,我们拟定下一步对荷B16小鼠瘤内注射重组菌的治疗方案为:以10⁷/ml的B16细胞100ul建模,肿瘤体积达100 mm³时开始以10⁹CFU/ml的重组沙门菌100ul行瘤内注射,注射重组菌后第二天予以自杀基因HSV-tk前体药物GCV 50mg/kg腹腔注射,Bid,连续五天,此为一疗程,共连续进行三疗程的治疗。将细胞浓度为10⁷/ml的小鼠黑色素瘤B16细胞0.1ml接种于C57BL/6J小鼠右背皮下成功建立小鼠黑色素肿瘤模型,建模后3天可触摸到微小瘤结节,第5天成瘤明显,第7天肿瘤体积可达100mm³,成瘤率为100%。HT组、H组、T组、Sa组分别以10⁹CFU/ml相应的重组沙菌100ul分两点瘤内注射,PBS予以100ul的PBS分两点瘤内注射,注射重组菌或PBS 1次,第二天予以GCV 50mg/kg溶于0.5mlPBS腹腔注射2次/天,连续5天,此为一疗程,游标卡尺每隔三天测量各组肿瘤长短径1次。连续治疗三个疗程,第三个疗程治疗结束时,统计分析各组肿瘤体积和瘤重的差异。开始治疗时各组肿瘤的体积即建模后第7天的肿瘤体积HT组101.54±4.52mm³;H组101.54±4.36mm³;T组100.37±3.74mm³;SA组100.18±6.41mm³,PBS组97.27±10.95符合方差齐性,方差分析组间差异无统计学意义（P＞0.05）;治疗结束时各组肿瘤的体积,HT组1366.77±401.15mm³;H组2351.34±819.075mm³;T组2511.09±809.105mm³;SA组2902.58±621.515mm³;PBS 6958.62±1200.40,符合方差齐性,方差分析组间差异有统计学意义（P＜0.05）,进一步以LSD法两两比较,HT组分别与H组、T组、Sa组、PBS组肿瘤体积差异有显著性（P＜0.05）;H组与T组、Sa组肿瘤体积差异无显著性（P＞0.05）,与PBS组肿瘤体积差异有显著性（P＜0.05）;T组与Sa组肿瘤体积差异无显著性（P＞0.05）,与PBS组肿瘤体积差异有显著性（P＜0.05）;Sa组与PBS组肿瘤体积差异有显著性（P＜0.05）。HT组肿瘤生长缓慢,H组、T组Sa组的肿瘤生长也受到一定程度的抑制,而PBS组肿瘤则快速生长。相对PBS组,根据抑瘤率公式:（PBS组平均瘤体积-实验组平均瘤体积）/PBS组平均瘤体积×100%得出第三个疗程治疗结束时HT组抑瘤率为80.30%;H组抑瘤率为66.20%;T组抑瘤率为63.91%;Sa组抑瘤率为58.29%。治疗结束时肿瘤瘤重HT组1.9586±1.1095g;H组3.0433±1.6854g;T组3.3943±1.5035g:Sa组3.9327±0.6607g;PBS组8.9173±1.1803g;方差分析组间差异有统计学意义（F=22.456,P=0.000＜0.05）。各组相对PBS组根据抑瘤率=（PBS组平均瘤重-实验组平均瘤重）/PBS组平均瘤重×100%,HT组抑瘤率78.04%;H组抑瘤率65.87%;T组抑瘤率61.94%;Sa组抑瘤率55.90%。HT组生存期显著长于各对照组。以流式细胞术检测CD3+＼CD4+:CD3+＼CD8+T淋巴细胞及NK细胞的分布,HT组CD8:41.67±12.14,CD4:31.81±8.02,NK:20.41±15.63;H组CD8:26.19±2.29,CD4:34.19±4.23,NK:18.95±11.00;T组CD8:23.48±1.43,CD4:29.91±6.27,NK:15.65±9.15;Sa组CD8:23.75±1.25,CD4:27.12±5.29,NK:14.06±5.32;PBS组CD8:20.38±1.66,CD4:30.37±1.94,NK:16.22±5.37。CD3+＼CD8+组间方差不齐,采用welch检验,组间差异有显著性（P＜0.05）,HT组显著高于各对照组（P＜0.05）:CD3+＼CD4+及NK细胞组间方差齐,方差分析,组间差异无显著性P＞0.05。Elisa检测重组疫苗治疗后荷瘤小鼠瘤组织IFN-γ的含量结果（pg/ml）:HT组150.4098±58.2892;H组67.6573±24.3157:T组57.7418±36.9552;Sa组42.5049±29.2696;PBS组25.1185±11.6308。瘤组织IFN-r指标在组间不符合方差齐性,用welch检验,各组间差异具有显著性,P＜0.05,（H=25.639,P=0.000）:HT组显著高于各对照组。HT重组疫苗治疗后荷瘤小鼠瘤组织病理切片HE染色可见瘤组织内及周围大量淋巴细胞募集,肿瘤组织大量坏死和凋亡,免疫荧光结果可见大量的CD8+T淋巴细胞浸润肿瘤组织内;Tunel法检测到经HT重组疫苗治疗后荷瘤小鼠瘤组织瘤细胞大量凋亡。重组沙门氏菌瘤内注射后,电镜下观察到大量的重组菌侵入肿瘤细胞内,位于肿瘤细胞的胞浆内,细菌可在肿瘤细胞胞浆内进行有丝分裂增殖,肿瘤细胞发生细胞溶解,HT组及T组均可见肿瘤细胞出现细胞核固缩,核边集的细胞凋亡现象和内质网肿胀、细胞溶解坏死、微血管断裂;H组和Sa组可见内质网肿胀、细胞溶解坏死及凋亡;PBS组电镜下未见肿瘤细胞明显的改变,黑色素颗粒明显,肿瘤细胞器完整。我们对重组疫苗治疗后做了安全性评估,以10⁹CFU/ml的重组沙门菌行瘤内注射100ul后,小鼠的生存状态良好,无腹泻,肿瘤局部无脓肿坏死,治疗期间体重无明显改变,取经重组菌治疗后荷瘤小鼠肝、肾、肺、胃、脾HE切片检查,均未见明显病理改变。[结论]:①本实验通过酶切鉴定,成功构建重组质粒pCMV-mtHSP70-IRES-TK、pCMV-TK-IRES-EGFP、pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP。②重组质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK、pCMV-TK-IRES-EGFP、pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP能在体外B16细胞中正确表达目的基因及含TK基因的质粒体外在GCV的作用下具有抗小鼠黑色素瘤细胞B16的效应。③重组沙门菌构建成功,减毒沙门菌携带质粒具有稳定性,对小鼠黑色素B16肿瘤细胞具有侵袭性并能在B16细胞中表达目的基因的蛋白。④动物实验结果表明以减毒沙门菌携带的mtHSP70/HSV-tk双基因真核共表达重组DNA疫苗瘤内注射对B16肿廇细胞具有靶向性且能引起强烈的细胞毒性T细胞反应,能显著抑制肿瘤的生长。该策略安全有效。