东亚钳蝎氯离子通道毒素（BmK CT）是蝎氯毒素的一个亚型，由36个氨基酸组成，含有4对二硫键，与以色列金蝎氯离子通道毒素有68％的同源性且具有相似的生物学功能。BmK CT能选择性抑制胶质瘤细胞表面广泛分布的氯离子通道，并且能抑制胶质瘤细胞中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的分泌和活性，从而抑制胶质瘤增殖、迁移和侵袭的能力。BmK CT在胶质瘤诊断和治疗上的应用主要是两方面：一是介导纳米药物的靶向给药；二是辅助造影，准确判断胶质瘤和正常脑组织的边缘界限。　　神经胶质瘤（Glioma）是最常见的原发性脑肿瘤，约占所有脑部中枢神经系统肿瘤的30%和所有恶性脑肿瘤的80%。患有恶性胶质瘤病人的平均生存期在过去几十年并没有明显的延长，仍然保持在一年左右。替莫唑胺（TMZ）作为一种小分子口服化疗药，是治疗恶性胶质瘤的首选药物。TMZ的主要功能是使胶质瘤细胞的O6甲基鸟嘌呤DNA烷基转移酶失活，引起DNA损伤，最终导致胶质瘤细胞的凋亡。然而，化疗耐药性的存在导致了疗效的不佳。　　本实验室前期证实BmK CT能抑制胶质瘤细胞的增殖，但是其分子机制尚不清楚。因此，本研究首先将探讨BmK CT抑制胶质瘤U251细胞增殖的机制，其次验证BmK CT能否缓解TMZ的化疗耐药性，增强其对胶质瘤的杀伤作用。　　本研究构建了重组质粒pGEX-6P-1-BmK CT，转化至BL21表达菌，经IPTG诱导、表达和纯化，最后将重组蛋白GST-BmK CT浓缩至6 mg/ml。利用明胶酶谱实验证实GST-BmK CT能抑制U251细胞分泌基质金属蛋白酶MMP-2，MMP-2分泌抑制与 GST-BmK CT作用剂量呈正相关性。细胞划痕擦伤实验结果表明其能抑制 U251细胞的迁移。　　本研究结果显示，融合蛋白 GST-BmK CT能特异地抑制 U251细胞的增殖。GST-BmK CT刺激U251细胞96h，细胞周期各时相发生了明显的改变，U251细胞周期在S期和G2/M期发生阻滞。进一步发现GST-BmK CT能选择性的激活p38α，当用 p38MAPK信号通路特异性的抑制剂 SB203580预处理 U251细胞后再用GST-BmK CT做刺激发现，细胞周期各时相空白对照组相比在S期和G2/M期几乎没有阻滞，表明 p38α在 GST-BmK CT诱导的 U251细胞周期阻滞中起重要作用。MAPKAPK-2是p38αMAPK下游的一个直接激活靶标，更是一个DNA损伤细胞周期检验点激酶，本研究首次证实GST-BmK CT刺激U251细胞后，MAPKAPK-2被激活，当用 SB203580预处理后，MAPKAPK-2的激活明显减弱，更进一步证明了GST-BmK CT激活p38αMAPK信号通路的选择性。　　有报道证实TMZ作用胶质瘤细胞引起的凋亡是由于抑制了mTOR的激活，但是同时也导致了 Akt的进一步激活，这是导致耐药性产生的原因之一。我们发现GST-BmK CT能选择性地抑制 AKT的活化，同时发现其能激活 PTEN的转录，而GST和TMZ均无此功能。当GST-BmK CT与TMZ联合使用的时候，能更有效地诱导U251细胞周期阻滞和凋亡。进一步分析发现，GST-BmK CT作用U251细胞后，能显著下调Bcl2的表达，同时上调Bax、Caspase3和Caspase9的表达。GST-BmK CT联合TMZ能更快的诱导Bcl2表达的下调和Caspase9表达的上调，加快凋亡信号的产生。这部分内容证实了GST-BmK CT通过抑制Akt信号通路，增强了TMZ的细胞毒性，从而更加有效的诱导U251细胞周期阻滞和凋亡。我们推测GST-BmK CT蛋白联合TMZ是治疗恶性胶质瘤的一个有前途的组合。　　本研究旨在揭示BmK CT抑制胶质瘤增殖的机制，以及解除TMZ耐药性、增强TMZ杀伤胶质瘤的机制，为进一步探讨治疗神经胶质瘤的新途径和方法提供实验数据。