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背景:胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)是一种起源于胆道上皮细胞恶性增殖的肿瘤,是全球第二常见的肝胆恶性肿瘤。其特点是早期侵袭,预后差,是一种高致死率癌症,且近年来,胆管癌的发病率与死亡率逐年上升。目前治疗手段主要为手术,但仍有较高的复发率,且对顺铂等化疗药物耐药。因此,急需寻找有效的治疗方法及药物来提高胆管癌患者的生存期,改善预后。紫檀芪(Pterostilbene,Pte)作为一种从植物的提取物中发现的天然化合物,具有抗炎,抗肿瘤,抗氧化等多种药理作用。既往实验研究表明,紫檀芪具有抗多种肿瘤的活性,包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌等。然而,其对胆管癌的作用及其具体机制尚不清晰。在本研究中,我们发现紫檀芪具有抑制胆管癌细胞增殖的作用,通过诱导细胞发生S期阻滞、引发细胞发生非凋亡依赖细胞空泡化死亡以及增强Beclin-1/ATG5介导的自噬来发挥抗胆管癌的作用。此外,通过构建胆管癌荷瘤小鼠模型,验证了紫檀芪在体内治疗胆管癌的安全性及有效性,为胆管癌的治疗提供了新的实验依据和理论基础。目的:探究紫檀芪是否具有抑制胆管癌细胞增殖的作用和其可能的机制,以及紫檀芪在体内治疗胆管癌的有效性及生物安全性,为胆管癌药物研发和治疗提供新方向。方法:1.紫檀芪的体外抗胆管癌活性和机制的研究1)紫檀芪对胆管癌细胞的作用。用不同浓度的紫檀芪处理胆管癌细胞24、48、72h后,利用CCK法来检测细胞活性,并计算出药物的IC50;通过细胞计数实验、成克隆实验来检验紫檀芪对胆管癌细胞增殖率的影响。2)利用流式细胞术和蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测紫檀芪处理后胆管癌细胞周期和周期相关蛋白并进行定量。3)利用光学显微镜和电子显微镜观察紫檀芪作用细胞后的细胞形态学变化;运用流式细胞术来检测紫檀芪对胆管癌细胞凋亡率的影响;凋亡抑制剂Z-VAD和紫檀芪联合处理胆管癌后检测细胞活性和观察细胞形态学。4)紫檀芪诱导胆管癌细胞自噬作用的研究。通过蛋白免疫印迹法对药物作用后的细胞自噬相关蛋白Beclin-1、ATG5、LC3I/II、p62表达进行检测;通过电镜观察药物对细胞形态学的影响以及是否有自噬体的形成;利用共聚焦显微镜观察细胞LC3颗粒积累量和荧光强度;用紫檀芪联合自噬抑制剂3-MA联合干预细胞后检测细胞活性、观察细胞形态和LC3颗粒积累量。2.紫檀芪体内治疗胆管癌荷瘤小鼠的生物有效性和安全性构建HCCC-9810胆管癌皮下荷瘤小鼠模型,给予紫檀芪腹腔注射,监测对照组,低剂量紫檀芪组,高剂量紫檀芪组的肿瘤生长速度,最终体积大小和重量来研究紫檀芪对胆管癌生长的抑制所用,探究药物的有效性;测量小鼠体重变化以及脏器病理切片检测紫檀芪的毒性反应,证实其安全性。结果:1.紫檀芪的体外抗胆管癌活性和机制的研究1)紫檀芪具有抑制胆管癌细胞活性、增殖、成克隆能力的作用,这种抗胆管癌能力与药物作用浓度和时间成反比。2)紫檀芪通过诱导S期相关蛋白Cyclin A2、CyclinE1、P53的表达从而使胆管癌细胞发生S期阻滞。3)光镜和电镜下观察紫檀芪处理后的胆管癌细胞出现胞质空泡化现象,呈剂量依赖性,然而并没有出现胞质收缩、核碎裂、凋亡小体等典型凋亡特征,凋亡流式结果进一步证明紫檀芪并不通过凋亡途径抑制胆管癌,紫檀芪与凋亡抑制剂Z-VAD联用并不能逆转其对胆管癌细胞形态学和活性的影响。4)电镜可以观测到,紫檀芪作用胆管癌细胞后,细胞胞质自噬体增多;紫檀芪的作用使胆管癌细胞中Beclin-1、ATG5、LC3II表达增加,LC3I和p62表达减少,呈剂量依赖性;共聚焦结果显示,紫檀芪能够诱导胆管癌细胞内LC3颗粒增多,荧光强度增强;自噬抑制剂3-MA能逆转紫檀芪对胆管癌细胞活性的影响、细胞胞质空泡化和LC3颗粒形成,这些表明紫檀芪激活人胆管癌细胞中的自噬信号,并且胞质空泡形成与自噬有关。2.紫檀芪体内治疗胆管癌荷瘤小鼠的生物有效性和安全性紫檀芪明显抑制了胆管癌荷瘤小鼠的肿瘤生长速度,移植肿瘤的大小和重量均较对照组小;荷瘤小鼠的体重和心、肝、脾、肺和肾的病理切片与对照组小鼠并无差别,证实了在有效浓度下,紫檀芪能有效抑制胆管癌的生长,且不会产生任何毒性反应,为紫檀芪的安全性和有效性提供了有效证据。结论:1、紫檀芪以时间依赖性和剂量依赖性的方式抑制胆管癌细胞活性和增殖。2、紫檀芪可以增强CyclinA2、CyclinE1和p53蛋白的表达,从而诱导胆管癌细胞发生S期停滞。3、紫檀芪主要通过激活胆管癌细胞自噬流而非通过诱导细胞发生凋亡来发挥其抑制作用,且增强的自噬流与紫檀芪诱导胆管癌发生胞质空泡化现象成正相关。4、紫檀芪在体内可以有效抑制胆管癌肿瘤生长,且无任何不良反应,有潜力作为治疗胆管癌的候选辅助药物。