单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,简称Lm）是一种威胁食品安全的常见致病菌,在自然界中广泛存在。由Lm引发的感染会造成孕妇流产,新生儿、老年人以及免疫缺陷或低下病人罹患脑膜炎、败血症等。Lm能在低温、高盐、氧化胁迫等不利环境中存活,因此防治Lm污染十分重要。食品加工过程中,常用到H202、NaClO等氧化类消毒剂来防控细菌污染,但所形成的氧化环境会激发细菌内氧化应激机制抵抗氧化伤害。这些机制包括对氧化物质的清除和受损细胞的修复,例如细菌中抗氧化应激物过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）能够清除过量ROS,包括c-di-AMP在内的一些信号分子以及SOS反应则参与细胞DNA损伤修复过程。不过细菌启动氧化应激机制是一个复杂的过程,常常需要调控因子的参与。Lm中存在一种全局转录调控因子CodY,已证明参与细菌毒力、鞭毛运动、碳氮代谢等多种生命活动过程,但CodY在Lm抵抗氧化胁迫中的作用尚未见报道。本文利用H2O2对处于对数中期（OD600 nm=0.65）的Lm野生株EGDe和CodY（由codY编码）缺失株EGDe△codY进行胁迫,探究CodY在氧化物质的清除和受损细胞的修复过程中的作用及其调控机制。研究内容及过程下:首先通过观察H2O2胁迫下两株菌的抗氧化胁迫能力、生长特性差异,验证CodY是否参与Lm抗氧化胁迫过程。接着研究CodY在氧化物质的清除方面的作用,通过比较两菌株中CAT、SOD和GSH的水平以及相应编码基因的转录表达变化,探究CodY对Lm中不同抗氧化应激物表达的影响;由此进一步深入探究CodY对抗氧化应激物表达的调控机制,根据GSH编码基因gshF上游启动子与CodY的结合情况,来阐明CodY对GSH表达的具体调控机制。最后研究CodY在细胞损伤修复方面的作用,通过比较两菌株中第二信使c-di-AMP的水平差异,初步探索c-di-AMP是否参与Lm抗氧化胁迫过程以及其表达是否受到CodY的影响;对比两菌株基因组DNA损伤情况以及参与DNA损伤修复的SOS反应中重要基因的表达差异,探究CodY在细胞基因损伤修复中的作用。实验结果显示:（1）H2O2对EGDe的MIC和MBC大约是EGDe△codY的2倍,当H2O2浓度超过20 mmol/L时,EGDe△codY抑菌圈直径极显著大于EGDe（P≤0.01）;200 mmol/LH2O2可完全抑制EGDe△codY生长,但仅减慢EGDe的生长速率;200 mmol/L H2O2对两株菌生物被膜的形成均产生不利影响,胁迫时间达到20min时,EGDe尚可形成结构松散的生物被膜,而EGDe△odY无法形成结构完整的生物被膜。以上结果表明CodY参与了 Lm抗氧化胁迫过程,其缺失会导致Lm的抗氧化能力减弱,能够被更低浓度的H2O2抑制或是杀死,同时在氧化环境下更加难以形成生物被膜。（2）H2O2胁迫使EGDe和EGDe△codY中CAT酶活均下降,但转录水平并没有显著变化;SOD酶活在两菌株内无明显变化,但转录表达水平在EGDe和EGDe△codY中差异高度显著（P≤0.001）;值得注意的是,GSH编码基因的转录表达和其含量在EGDe和EGDe△codY中变化趋势基本一致,随H2O2胁迫时间增加呈先显著下降后再略微上升,而且与EGDe相比,GSH在EGDe△codY中的转录表达水平差异极显著（P≤0.01）。说明氧化胁迫下CodY对CAT、SOD和GSH的表达在转录水平和最终物质生成水平的作用机制和影响程度均有所差异。（3）根据基因组序列分析发现GSH编码基因gshF上游启动子区域存在有CodY-box,本文利用凝胶阻滞电泳（EMSA）实验和等温滴定量热（ITC）技术在体外条件下检测CodY蛋白与gshF启动子区域的结合情况,探究CodY对GSH表达调控作用。EMSA结果显示当反应体系中只含CodY蛋白和gshF启动子探针时,能够观察到迁移速率较慢的电泳条带,且条带清晰明显,说明二者发生较强结合;ITC结果显示出二者之间产生了结合反应热,同样证明了 CodY蛋白与gshF启动子区域的CodY-box序列发生结合。以上结果表明CodY能够作用于gshF启动子区,从而直接调控Lm中GSH的表达水平。（4）氧化环境下,与EGDe相比,EGDe△codY中c-di-AMP合成酶基因dacA相对表达水平更低,水解酶基因pdeA和pgpH相对表达水平更高,在氧化胁迫10 min时差异最显著（P≤0.01）,同时其ATP含量也高度显著降低（P≤0.001）。以上结果表明CodY缺失导致c-di-AMP合成受到影响。由于c-di-AMP在细菌DNA损伤修复信号通路中具有重要作用,因此CodY通过调控c-di-AMP的合成而间接帮助Lm抵御氧化胁迫造成的损伤。（5）通过随机扩增多态性DNA（RAPD）技术比较两菌株基因组模板稳定性（GTS）;利用RT-qPCR检测两菌株抗氧化应激物编码基因以及SOS反应重要基因的转录表达变化,结果显示:H2O2胁迫下EGDe和EGDe△codY的GTS分别为93.1%和80.0%,暗示了 CodY缺失影响了 Lm基因组的稳定性,细菌DNA受到氧化胁迫后损伤更严重;RT-qPCR显示无论受H2O2胁迫较短时间（10 min和20 min）或是长达40min条件下,EGDe△codY中参与SOS反应的重要基因（recA、lexA、recR、lmo1302、lmo1975）的转录表达普遍受到高度显著抑制（P≤ 0.001）,而EGDe中recA、lmo1302和lmo1975的转录表达被激活,lexA和recR的转录表达情况则与胁迫时间有一定关系,在胁迫10 min和40 min时的转录表达被激活,胁迫20 min时的转录表达与未受胁迫野生株EGDe相比没有明显变化。以上结果表明CodY缺失会显著影响DNA损伤修复重要基因的转录表达,使得细菌基因组损伤更严重,抵御氧化胁迫能力更弱。综上所述,CodY缺失导致Lm在H2O2胁迫环境下的耐受能力和生长速率显著降低,抗氧化应激物CAT酶活和GSH含量下降,其中CodY能够与gshF启动子区结合进而直接调控GSH的水平。同时CodY缺失还造成Lm DNA损伤修复通路中信号分子c-di-AMP合成受到显著影响,参与DNA损伤修复的SOS反应中重要基因的表达也受到显著抑制,使得细菌基因组模板稳定性降低。据此我们确定了 CodY在Lm抵御H2O2氧化胁迫中发挥了重要的调控作用,并初步探讨了其调控机制,为医疗、食品和工业生产中H2O2的合理使用策略,以及预防和治疗李斯特菌病提供理论依据。