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桑树作为一种重要的经济作物，已经有几千年的种植历史，不仅可以作为家蚕的饲料，还具有重要的药用价值。黄酮类化合物是植物体内重要的次生代谢产物之一，而花青素是其中一种重要的分支产物，具有重要的开发利用价值。本课题组前期对桑树黄酮类化合物的含量、成分分离纯化以及调控其生物合成的部分基因进行了研究，克隆出黄酮类生物合成的4个关键基因 PAL、C4H、4CL与CHS全长。本研究以桑树为材料，克隆了由苯丙氨酸途径转向花青素合成途径中三个基因F3H、ANR和FLS的cDNA全长序列。利用荧光定量PCR技术分析了以上三个基因在不同种质叶片中的表达情况，并与总黄酮和总花青素含量进行了比较分析。本研究对培育富含黄酮类化合物的桑树种质材料提供参考依据。主要研究结果如下： 1、桑树黄烷酮3-羟化酶基因（F3H）的克隆及序列分析 黄烷酮3-羟化酶（F3H）是控制花青素和其他黄酮类化合物合成的分支点，影响不同种类黄酮类化合物的合成。通过 RT-PCR和 RACE技术，以桑树幼叶cDNA为模板，克隆了F3H基因全长序列，命名为MmF3H（GenBank登录号：KU301748）。该基因cDNA全长为1376bp，其中编码区为1095bp，编码365个氨基酸，还包含130bp的5?端和151bp的3?端非编码区。预测其编码蛋白质的等电点为4.93，分子量为113.728kD，与NCBI中其他6种F3H进行氨基酸序列比对，结果显示有较高的同源性（79％以上）。 2、桑树花青素还原酶基因（ANR）的克隆及序列分析 花青素还原酶（ANR）催化由花色素生成反式黄烷-3-醇的反应。通过RT-PCR和RACE技术，以桑树幼叶cDNA为模板，克隆到ANR基因全长的克隆，命名为MmANR（GenBank登录号：KU507307）。该基因cDNA全长为1129bp，其中编码区为1011bp，编码337个氨基酸，还包含115bp的5?端非编码区和一个终止密码子。预测该基因编码蛋白质的等电点为6.51，分子量为36.612kD，与NCBI中其他6种ANR进行氨基酸序列比对，结果显示有较高的同源性（77%以上）。 3、桑树黄酮醇合成酶基因（FLS）的克隆及序列分析 黄酮醇合成酶（FLS）催化由二氢黄酮醇合成黄酮醇的反应。通过 RT-PCR和RACE技术，以桑树幼的cDNA为模板，克隆了FLS基因全长，命名为MmFLS（GenBank登录号：KU507308）。该基因cDNA全长为1074bp，其中编码区为1005bp，编码335个氨基酸，还包含66bp的5?端非编码区和一个终止密码子。预测该基因编码蛋白质的等电点为5.55，分子量为37.981kD，与NCBI中其他6种FLS进行氨基酸序列比对，结果显示有较高的同源性（68%以上）。 4、F3H、ANR、FLS在不同种质间的表达差异分析 三个基因荧光定量 PCR分析及桑叶总黄酮和总花青素含量测定结果表明，F3H、ANR和FLS在不同桑树种质间表达水平差异显著；F3H基因表达水平与总黄酮含量有一定的相关性，与花青素含量相关性不大；ANR表达水平与总黄酮含量相关性不大，与花青素含量有一定的负相关性；FLS表达水平与总黄酮含量有一定的相关性，与花青素含量相关性不大。研究结果可为选育高黄酮含量的桑树品种提供参考。