目的：观察人肾上腺髓质素(Adrenomedullin，ADM)对体外培养的活化正常大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖及其细胞周期相关蛋白表达的影响，初步探讨ADM对肝星状细胞增殖的作用及机制，以期为临床预防和治疗肝纤维化提供理论依据。 方法：大鼠肝星状细胞系(HSC-T6，其表型为活化的HSC)以10％胎牛血清RPMI-1640培养基、37℃、5％CO2常规培养。预先将ADM0.1mg(合1.6586×10-8mol)溶于10ml培养基(合1.6586×10-4mol/L)，备用。 1.MTT检测HSC-T6增殖：取生长良好的HSC-T6，经0.25％胰酶消化，用培养基制备细胞悬液，种于96孔板中，每组设6个复孔。接种在96孔板中的细胞待24h后细胞贴壁，换用无血清RPMI-1640培养基同步化处理24h后，加入ADM作用，根据作用时间不同分组如下：Ⅰ组(12h组)；Ⅱ(24h组)；Ⅲ(48h组)；Ⅳ组(Oh组即Oh对照组)。各组又根据加入ADM量不同分组如下：A、B、C、D组，分别加入200 μL含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养液的细胞悬液(ADM为0，即ADM对照组)；加入ADM液及细胞悬液共200μL使ADM终浓度达10-7mol/L；加入ADM液及细胞悬液共200μL使ADM终浓度达10-8mol/L；加入ADM液及细胞悬液共200μL使ADM终浓度达10-9mol/L另设V(空白对照组)：上酶标仪检测前，只加入含100 mL/L的胎牛血清的RPMI-1640培养液200μL(不含细胞)。ADM作用后，每孔加入MTT液反应，再加入二甲基亚砜(DMSO)，后用酶标仪测定490nm波长的吸光度(A490)值。细胞抑制率(CPIR)=(1-实验组平均A490值/对照组平均A490值)×100％。 2．免疫细胞化学法(SABC法)检测细胞内增殖核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)，细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞周期素依赖性激酶抑制因子P21wafl的表达。取生长良好的HSC-T6，经0.25％胰酶消化，用培养基制备细胞悬液，种于6孔板中，每组设3个复孔。细胞待24h贴壁后，换用无血清RPMI-1640培养基同步化处理24h后，加入ADM作用，根据作用时间不同分组为：Ⅰ组(12h组)；Ⅱ(24h组)；Ⅲ(48h组)。 又根据加入的ADM的量不同分组如下：A、B组，分别加入含100mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养液的细胞悬液1mL(ADM为0，即ADM对照组)；加入ADM液和细胞悬液使总量达1mL使其终浓度达ADM10-7mol/L。各组分别作用后，分别加入4％多聚甲醛室温固定，加入0.3％Triton X-100作用，加入3％过氧化氢(H2O2)作用，后按照SABC试剂盒操作(其中阴性对照组加入蒸馏水代替一抗)，苏木素复染，分化，梯度脱水，透明后用中性树胶封片。 结果判定：胞核呈棕黄色为阳性，并对染色后的细胞片进行显微镜下观察，摄片，Image-Pro Plus软件分析平均光密度，相对定量它们表达的强度。 结果： 1.MTT检测ADM对HSC-T6细胞增殖的影响：统计学分析结果：在12h，24h，48h时间点ADM10-7mol/L组(其A490值分别为：Ⅰ B组0.162±0.037，ⅡB组0.136±0.018，ⅢB组0.134±0.018)与相应时间对照组(Ⅰ A组0.249±0.077，ⅡA组0.254±0.054，ⅢA组0.356±0.051)比较A490值明显降低，差异有显著性(P<0.05：ⅠB vs ⅠA，t=10.646，ⅡB vs ⅡA，t=16.333，ⅢB vs ⅢA，t=24.516)，而其它浓度组与对照组比较差异均无显著性(P>0.05)。ADM10-7mol/L各实验组与Oh对照组(ⅣB组：0.195±0.052)相比差异有显著性，具有统计学意义(P<0.05：ⅠB，ⅡB，ⅢB vs ⅣB，t值分别为4.003，4.543，4.857)，其12h，24h，48h抑制率逐渐增加，分别是7.88％，17.58％，18.79％，ADM10-7mol/L组随着时间的延长HSC-T6的A490值逐渐降低，抑制率逐渐增加，对其抑制作用逐渐加强，各时间点之间两两比较24h和48h组各与12h组相比差异有显著性(P<0.05：ⅡB，ⅢB vs ⅠB，q值分别为3.857，3.951)，24h组与48h组相比差异无显著性(P>0.05：ⅡB vs ⅢB)。 2．免疫组化检测HSC内PCNA，cyclin D1，P21wafl表达的结果： ①PCNA：细胞经ADM 10-7mol/L浓度作用后，其PCNA蛋白表达明显减弱，其胞核颜色明显减淡，各时间点对照组(其平均光密度值分别为：ⅠA组0.370±0.032，ⅡA组0.387±0.023，ⅢA组0.405±0.019)与相应实验组(IB组0.308±0.029，ⅡB组0.246±0.030，ⅢB组0.241±0.012)比较差异均有统计学意义(P<0.05：ⅠA vs ⅠB．ⅡA vs ⅡB，ⅢA vs ⅢB，t值分别是4.107，5.149，5.232)，各实验组时间点之间两两比较24h和48h组各与12h组相比差异有显著性(P<0.05：ⅡB．ⅢB vsⅠ B，q值分别为5.100，6.633)，24h组与48h组相比差异无显著性(P>0.05：ⅡB vs ⅢB)。 ②cyclin D1：细胞经ADM作用后其cyclin D1蛋白表达明显减弱，其胞核颜色明显减淡，各时间点对照组的平均光密度值分别为：ⅠA组0.450±0.045，ⅡA组0.454±0.029，ⅢA组0.461±0.022，各相应实验组的平均光密度值分别为：ⅠB组0.258±0.036，ⅡB组0.209±0.014，ⅢB组0.185±0.031，各对照组和实验组比较差异均有统计学意义(P<0.05：ⅠA vs ⅠB，ⅡA vs ⅡB，ⅢA vs ⅢB，t值分别是4.807，5.572，6.039)，各实验组时间点之间两两比较24h和48h组与12h组差异无显著性(P>0.05：ⅠB vs ⅡB vs ⅢB)。 ③P21wafl：细胞经ADM作用后其P21wafl蛋白表达增加强，其胞核颜色明显加深，各时间点实验组的平均光密度值(ⅠB组0.298±0.028，ⅡB组0.308±0.011，ⅢB组0.317±0.025)比对照组(ⅠA组0.195±0.034，ⅡA组0.201±0.033，ⅢA组0.212±0.029)明显增加，统计学上差异有显著性(P<0.05：ⅠA vs ⅠB，ⅡA vs ⅡB，ⅢA vs ⅢB，t值分别是4.721，5.299，4.036)，各实验组时间点之间两两比较差异无显著性(P>0.05：ⅠB vs ⅡB vs ⅢB)。 ④ADM作用HSC后细胞内PCNA，cyclin D1，P21wafl三者表达的相关性分析：PCNA和cyclin D1的变化呈直线相关关系，有统计学意义(r=0.834，P<0.05)，具有正相关变化趋势，PCNA和P21wafl变化呈直线相关关系，有统计学意义(r=-0.770，P<0.05)，具有负相关变化趋势，cyclin D1和P21wafl的变化呈直线相关关系，有统计学意义(r=-796，P<0.05)，具有负相关变化趋势。 结论： ①肾上腺髓质素在10-7mol/L浓度作用于体外培养HSC可以抑制其增殖率，在24小时内呈时间依赖趋势。 ②10-7mol/L浓度肾上腺髓质素作用HSC后，HSC细胞内PCNA，cyclin D1表达减弱，P21wafl表达增强。 ③10-7mol/L浓度ADM作用HSC后，PCNA和cyclin D1的变化具有正相关变化趋势，PCNA和P21wafl变化具有负相关变化趋势，cyclin D1和P21wafl的变化具有负相关变化趋势。表明ADM作用于HSC可能是通过调控HSC的细胞周期，抑制HSC的PCNA，cyclin D1的表达，促进P21wafl的表达，使HSC停滞于G0/G1期，从而发挥抑制HSC增殖作用。