胰腺癌是目前已知的恶性度很高的肿瘤之一，其死亡和发病率之比为0.99:1，在美国癌症死亡原因中，胰腺癌居第四位。近些年来，我国胰腺癌的发病率呈上升趋势。2000年上海全市新发现胰腺癌病人共1311例，发病率为10.0/10万，年龄标化发病率为6.0/10万，在全市恶性肿瘤发病率顺位中排第8位。因胰腺癌发现较晚，侵袭性强、恶性程度高、手术切除率低、易产生化疗耐药性，预后差、死亡率接近100％，迫切需要寻找用于早期诊断的特异性分子标志物和替代性分子靶向治疗。　　 microRNA(miRNA)是一类长度为18～25个核苷酸(nt)的非编码小RNA，在基因转录后水平调控基因的表达。其作用机制是miRNA与其靶mRNA的3’UTR区互补，当部分配对时阻抑靶mRNA的翻译，与靶基因3’UTR区域完全配对时，使靶mRNA降解。经预测microRNA可能控制哺乳类动物30％的蛋白编码基因的活性，与其靶mRNA分子组成了一个复杂的调控网络，参与包括细胞增殖、凋亡、细胞分化、发育和逆境应答等多种生物学过程。有研究报道显示，miRNA在多种肿瘤中表达有改变，可能与肿瘤的发生、细胞凋亡和细胞的生长等有关，被认为可能起癌基因或抑癌基因的作用，因此用拮抗剂抑制microRNA或恢复microRNA功能，将具有一定的治疗意义，已在最新的研究中证实。因此microRNA为解决胰腺癌的诊断和治疗提供了可能性。　　 据报道miRNA在人类多种肿瘤包括胰腺癌中起重要作用。随着miRNA在胰腺癌的研究越来越多也越来越深入。不仅通过microarry方法获得胰腺癌的miRNA表达谱，了解胰腺癌中所表达的miRNA，而且了解了许多胰腺癌中差异较大的miRNA的表达量的变化：miR-21、miR-18a、miR-196a、miR-10b、miR-16、miR-155、miR-181a、miR-181b、miR-200b、miR-200c、miR-210上调；miR-34a、miR-101、let-7a、b、miR-217、miR-146、miR-148下调。已有文献报道认为这些在胰腺癌中表达有差异的microRNA(miRNA)在胰腺癌的生物学行为中起重要作用，例如：增殖、侵袭、转移、凋亡、药物抵抗及胰腺癌的发病机制等。microRNA(miRNA)在胰腺癌的功能研究涉及从生物学到疾病标志的研究。因此，miRNA可以用于胰腺癌的诊断、预后、药物及手术效果的评价。　　 miR-26a含有21个核苷酸(nt)，位于人3号染色体3P21.3，在人的大多数组织中表达，经序列分析显示，miR-26a常位于染色体的不稳定位点。通过基因数据分析，确定miR-26a与CDK4和CENTG1共同组成一个扩增子，而CDK4和CENTG1作为癌基因分别调控RB1和PI3/AKT通路。Zcchc11(zinc-finger，CCHCdomain-containing protein 11)通过其尿苷化酶的作用维持miR-26族miRNA的3’末端的A尾，从而影响miR-26族miRNA生物学功能，另有文献报道，miR-26a的活性受到myc的调控。目前已证实，在肿瘤中miR-26a的直接作用靶点有Ezh2、PTEN、cyclinD2、cyclinE2、GSK-3β；功能相关的靶点有：Rb1、MAP3K2/MEKK1和SMAD1。miR-26a通过作用于这些靶点，发挥其调控肿瘤细胞生物学行为的作用。有人通过检测肿瘤中miR-26a的表达量及其功能，认为miR-26a所起的作用较为复杂，在一些肿瘤中起抑癌基因作用，如肝癌，而在另一些肿瘤中则起癌基因作用，如胶质瘤。有文献报道，通过microarray方法确定miR-26a在胰腺癌中表达，但miR-26a在胰腺癌中的研究尚未深入。　　 基于miR-26a的研究现状及其在肿瘤发生发展中的作用，本课题的研究目的是检测miR-26a在胰腺癌组织中的表达情况，然后通过改变miR-26a的表达水平观察其对胰腺癌细胞生物学特性的影响，并分析其可能作用的靶标在胰腺癌中的改变，进一步阐明miR-26a在胰腺癌发病机制中的作用，为深入理解胰腺癌发病的分子机制及分子靶向治疗奠定理论基础。　　 (一)胰腺癌组织中miR-26a表达特性的鉴定　　 本实验用Real-timePCR方法检测胰腺癌及癌旁组织中的miR-26a表达量，结果显示miR-26a在癌组织中表达较癌旁组织下调。原位杂交实验验证了Real-timePCR的结果，miR-26a在胰腺癌癌旁的正常胰腺导管上皮中表达，而在胰腺癌的癌变导管上皮中表达较少或无，并且原位杂交实验直观地显示了miR-26a在胰腺组织中的定位，确定miR-26a定位表达于胰腺正常导管上皮的细胞质及胞核中，排除了胰腺癌组织中增生的纤维间质成分对Real-timePCR结果的影响，显示Real-timePCR结果能够说明miR-26a在癌及癌旁组织的表达变化。　　 (二)miR-26a过表达对胰腺癌细胞生物学特性的影响　　 用脂质体将miR-26a特异质粒转染入胰腺癌细胞中，并用Real-timePCR检测，荧光显微镜观察。结果证实，转染miR-26a特异表达载体可以提高胰腺癌细胞中miR-26a的表达水平。通过CCK-8增殖实验及流式细胞仪对细胞周期进行分析显示，miR-26a过表达对胰腺癌细胞的增殖、周期有显著影响。用westernblot方法检测了其靶蛋白cyclinE2的表达情况，结果显示，cyclinE2表达量减少，分析其作用机制可能是通过下调靶蛋白cyclinE2的表达，使细胞阻滞于G1期，抑制癌细胞增殖。　　 (三)miR-26a过表达抑制胰腺癌细胞的体内成瘤实验　　 成瘤实验结果显示，miR-26a稳定高表达(pTM)组肿瘤明显小于对照(pT)组，且差异具有统计学意义，表明miR-26a在细胞中稳定高表达后，瘤细胞在裸鼠体内增殖能力明显小于对照组。该结果与第二部分体外细胞学水平实验结果一致。　　 用免疫组化方法检测成瘤组织中cyclinE2及PCNA蛋白表达，结果显示，成瘤组织中cyclinE2和PCNA蛋白表达量均发生了变化，在miR-26a稳定高表达(pTM)组瘤组织较对照(pT)组明显减少，这在分子水平证实，miR-26a高表达的瘤细胞在裸鼠体内的增殖能力下降。　　 结论：　　 1.Real-timePCR及原位杂交实验结果均显示，miR-26a在胰腺癌组织中低表达，显示其参与了胰腺癌的发生发展，为进一步探讨miR-26a在胰腺癌发病机制中的生物学作用奠定了基础。　　 2.Real-timePCR和荧光显微镜观察结果显示，miR-26a表达质粒在胰腺癌细胞中稳定表达，证实miR-26a高表达稳转细胞株成功建立。　　 3.miR-26a在胰腺癌细胞中高表达组其细胞增殖能力明显低于对照组，流式细胞检测结果显示，细胞周期阻滞于G1期，推测miR-26a在胰腺癌中可能起抑癌基因的作用。　　 4.在裸鼠体内成瘤实验证实，miR-26a抑制了瘤细胞的增殖，表明miR-26a能抑制胰腺癌细胞的增殖。　　 5.miR-26a在胰腺癌中可能通过作用于其靶蛋白cyclinE2起作用，下调cyclinE2蛋白表达。