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目的:新近克隆出来的Ras相关区域家族1A基因(RASSF1A)已被确认为一种候选抑癌基因(TSGs),位于人类染色体3p21.3上。RASSF1A基因失表达见于多种人类肿瘤中。微卫星变异(MSI microsatellite alteration)是导致RASSF1A基因失活的重要机制,其参与了细胞凋亡信号的转导、微管的稳定作用和有丝分裂的进程,作为一种Ras负相调节因子阻止细胞生长,诱导细胞凋亡,促进肿瘤的发生和发展。微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)是指在复制过程中由于错配修复基因突变而引起的DNA基因组中简单重复序列的增加或丢失,也称为复制错误阳性或复制错误表型。目前人类的错配修复酶( mismatch repair enzyme,MMR)系统含有9个基因,其中hMLH1(human mut-l homologue 1,hMLH1)和hMSH2(human mut-s homologue 2,hMSH2)是人类错配修复系统中功能最重要的两个基因,主要作用是保持遗传物质的完整性和稳定性,保证DNA复制的忠实性。如果这些错配修复基因功能发生缺陷或活性降低,复制过程中出现的错误不能及时被纠正,就会导致MSI的出现,使整个基因组不稳定,随机突变率增高,从而引起肿瘤的发生。高危型人乳头状瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)尤其是HPV16与宫颈癌的发生、发展直接相关。本实验主要采用分子生物学方法观察分析慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变、宫颈鳞状细胞癌中MSI的存在情况,并在此基础上进一步探讨以上宫颈组织中hMLH1和hMSH2的低表达情况和HPV16的感染状况,通过研究三者之间的相关性,从而探讨宫颈癌发生、发展的分子机制。方法:1材料:阴道镜下活检及手术切除的新鲜宫颈病变组织包括慢性宫颈炎16例、宫颈上皮内瘤样变性CINI20例、CINII~CINIII31例(包括按FIGO,2000分期0期原位癌)、宫颈癌52例。宫颈癌按组织学分型:均为鳞癌;按组织学分级:高、中分化分化癌36例,低分化癌16例临床分期按FIGO,2000年标准: I期~II期37例,III期~IV期15例。同时取宫颈病变自身正常对照组织(如取材时可疑癌则取手术切除的标本边缘)119例。所有标本均为新鲜标本,﹣160℃液氮保存或4%多聚甲醛固定。所有病例术前均未接受任何抗肿瘤治疗,术后病理证实。2微卫星不稳定性MSI的检测:选用RASSF1A基因的D3S2832E、RH91127和SHGC-56838三个微卫星位点,采用聚合酶链反应-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染技术(PCR-SSCP)的方法来检测宫颈病变组织中RASSF1A基因MSI的情况。按照DNA提取试剂盒说明提取组织DNA,应用相应引物进行PCR扩增,扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染进行分析。检测结果判定:与正常组织相比,若病变组织出现DNA等位条带的数量改变或条带的移位及浓度改变,即判断为MSI阳性。3错配修复基因MMR的检测:采用免疫组织化学SP法来检测宫颈病变组织中hMLH1和hMSH2基因的低表达情况,从而研究二者与宫颈各级病变的关系。4 HPV16感染状态的检测:样本组织HPV PCR检测和电泳。若宫颈病变组织与HPV阳性标本对比,在对应位置处出现相同的条带,记为HPV阳性。5统计学方法:在宫颈各级病变中对RASSF1A基因的三个位点检测MSI的差异,hMLH1、hMSH2蛋白缺失表达水平的差异,HPV16的感染状况研究的计数资料用行乘列表chi-squareχ2检验和Fishers确切概率法,检验水准α为0.05,P<0.05差异具有显著性意义。宫颈病变MSI与错配修复基因MMR(本文即hMLH1、hMSH2)蛋白低表达的相关性采用spearman rank correlation相关性检验。所有的计算均用SPSS14.0软件包进行分析。结果:1.宫颈病变组织中MSI的检测:宫颈病变旁正常对照组织中未检测到微卫星的存在;而在119例宫颈病变组织慢性宫颈炎16例、宫颈上皮内瘤样变性CINI20例、CINII ~CINIII31例(包括0期原位癌)、高、中分化宫颈鳞状细胞癌36例、低度分化鳞状细胞癌16例,其中包括按FIGO,2000分期I期~II期37例、III期~IV期15例MSI的检出率分别为D3S2832E MSI的检出率为0.0%、0.0%、22.6%、13.9%、43.8%,包括I期~II期13.5%、III~期IV期46.7%;RH91127 MSI的检出率为0.0%、0.0%、19.4%、11.1%、43.8%,包括I期~II期13.5%、III期~IV期40.0%;SHGC-56838 MSI的检出率为0.0%、0.0%、19.4.4%、11.1%、43.8%,包括I期~II期10.8%、III~期IV期46.7%。经统计学分析,三个位点均在慢性宫颈炎与宫颈上皮内瘤样病变CIN、宫颈上皮内瘤样病变CIN与宫颈癌对照无统计学意义( P>0.05),做了进一步统计发现CINI与CINII~CINIII、宫颈高、中分化癌与低分化癌、I期~II期宫颈癌与III~期IV期宫颈癌对照有统计学意义(P<0.05)。2.hMLH1和hMSH2在宫颈病变组织中的表达结果:在119例宫颈宫颈病变组织慢性宫颈炎16例、宫颈上皮内瘤样变性CINI20例、CINII ~CINIII31例(包括0期原位癌)、高、中分化宫颈鳞状细胞癌36例、低分化鳞状细胞癌16例,按(FIGO,2000)分期,I期~II期37例、III期~IV期15例中hMLH1低表达率分别为18.8%、20.0%、48.4%、44.4%、75%、包括I期~II期43.2%、III~期IV期80.0%;而hMSH2低表达率分别为12.5%、10.0%、41.9%、27.8%、62.5%,包括I期~II期24.3%、III~期IV期73.3%。经统计学分析,hMLH1和hMSH2两种错配修复酶的低表达情况均在慢性宫颈炎与宫颈上皮内瘤样病变、宫颈上皮内瘤样病变与宫颈癌对照无统计学意义( P>0.05),做了进一步统计发现CINI与CINII~CINIII、宫颈高中分化鳞状细胞癌与低分化鳞状细胞癌、I期~II期宫颈癌与III期~IV期宫颈癌对照有统计学意义(P<0.05),hMLH1和hMSH2蛋白在宫颈病变中的低表达率随着宫颈病变级别的增高而增高。3.各组HPV16感染状况的检测:宫颈癌组与CIN组HPV感染阳性率明显高于慢性宫颈炎组。随着临床分期和组织学分级的增加, HPV感染率也逐渐增加,但差异无统计学意义( P>0.05)。而CINI与CINII~CINIII比较具有统计学意义(P<0.05)。4.宫颈病变中MSI与错配修复基因MMR(本文即hMLH1、hMSH2)蛋白低表达及HPV16的相关性:应用Spearman rank correlatoin相关分析检验表明,三者之间的相关系数rs=1,均为正相关。结论: 1.宫颈癌发生过程中MSI在宫颈癌中有较高的发生频率,提示可能存在经MSI途径发生的宫颈癌。2.三个微卫星位点(D3S2832E、RH91127和SHGC-56838)的MSI发生频率在宫颈上皮内瘤样病变(CINII~III)和宫颈鳞状细胞癌中较高,可能是宫颈癌MSI检出的敏感位点,这对临床MSI检测指标的选用有一定参考价值。3.在MSI宫颈癌的发生、发展过程中可能同时出现hMLH1和hMSH2表达降低,两者的表达降低在宫颈上皮内瘤样病变(CINII~III)和宫颈鳞状细胞癌中发生的频率较高,而在正常宫颈组织中没有表达降低, 4.HPV16的感染状况表明,宫颈癌组与CIN组HPV16感染阳性率明显高于慢性宫颈炎组,随着临床分期和组织学分级的增加, HPV16感染率也逐渐增加。5. MSI、MMR(hMLH1和hMSH2的低表达)和HPV16三者之间有相关性,并且都随着宫颈级别的增高而增高。在宫颈各级病变中hMLH1和hMSH2的低表达与MSI的表达及HPV16的感染状况有较好的相关性,通过这一结论推测HPV16感染可能促使hMLH1和hMSH2表达降低,从而导致MSI,三者共同作用促使宫颈癌的发生和发展,其具体机制仍需深入探讨。