生菜（Lactuca sativa）是一种十分重要的蔬菜作物,在全世界广泛种植。生菜栽培周期短,适于水培,多被用于植物工厂等新型农业的栽培和生产。生菜虽然含有丰富的维生素A和维生素K,但其90%以上组分为水,营养价值偏低。如何提高生菜的营养价值是生菜育种中的重要目标之一。红色的生菜含有丰富的花青素,可以有效提高生菜的营养价值。然而生菜叶片花青素的积累受光照的影响较大,不利于植物工厂等光照较弱的条件生长,因而培育出耐弱光的高花青素含量的红色生菜具有十分重要的应用价值。本实验室发现生菜叶片上的红色斑点受光照的影响较小,通过正向遗传学的方法对其遗传机理进行解析,最终克隆到两个与斑点形成有关的位点并精细定位了一个调控斑点多少的位点。同时结合转录组分析鉴定到与斑点形成有关的基因,并通过转基因验证这些基因的功能,最终建立了生菜叶片斑点形成的模型。主要结果如下:1、细胞学观察和代谢分析发现红色斑点是由于矢车菊素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷在上表皮、上表皮下层细胞和下表皮细胞中随机分布产生的。2、通过正向遗传学分析克隆到两个与斑点形成有关的基因,分别编码ANS和R2R3-MYB转录因子。在绿色生菜中ANS基因发生无义突变,转基因实验表明ANS基因可以使绿色叶片变红,说明ANS基因参与花青素的合成。此外,LSL2A基因的缺失也会使植株变绿。在绿色生菜中超量表达LSL2A,植株的叶片变红,并且转基因互补LSL2A后植株的叶片恢复斑点,说明LSL2A参与斑点的形成。转基因实验表明LSL2A的启动子存在时空表达模式,说明调控斑点形成的基因为LSL2A的上游调控基因。3、对145份野生材料和124份栽培材料进行LSL2位点序列分析一共获得了34个不同的LSL2基因序列,构建系统发育树发现这些序列可以分为3个分支。根据物种起源关系推测在远源物种L.virosa中存在3个拷贝,之后由于基因的丢失和复制出现不同拷贝数的现象。其中斑点植株LSL2的单倍型是从野生生菜L.serriola中选择而来。4、LSL3的候选基因编码C2H2类锌指蛋白。利用三代测序技术对斑点多的植株进行该区段的组装,并对该区间进行手工注释。之后通过不同材料的DNA重测序数据进行分析,确定ZFP基因上的点突变在斑点多的植株中特异性存在。通过构建系统发育树发现ZFP属于拟南芥中的C3类锌指蛋白,推测其参与小RNA的合成,从而影响转座子活性。5、对同一植株的红色斑点和绿色区域进行转录组测序鉴定到141个差异表达的基因,其中有5个参与花青素代谢途径,分别为CHS、DFR、ANS、b HLH43和LSL2。进一步分析发现LSL2A和LSL2B在斑点区域特异性表达。敲除LSL2A植株的斑点消失并且RT-PCR结果显示LSL2B不表达,说明斑点的形成与LSL2A有关,并且LSL2B的表达受LSL2A调控。6、通过构建斑点和红色生菜的遗传分离群体,将控制该性状的基因定位在LSL2位点。qPCR结果显示LSL2A在红色植株中高表达,在斑点植株中低表达。序列分析发现斑点植株的LSL2A的启动子存在2-bp的插入。启动子活性实验表明2-bp的插入会显著降低其转录活性。遗传转化RLL2A至绿色植株中叶片恢复红色,证明启动子的变异会影响该基因的表达,从而引起叶色的变异。对GWAS群体的LSL2位点进行分析发现斑点植株均含有2-bp的插入,并且qPCR结果显示LSL2A的表达量都显著下调,说明栽培生菜中的斑点表型均是由于LSL2A启动子区域的变异导致的。本研究克隆了两个斑点形成相关的基因,并精细定位了一个调控斑点密度的位点。斑点产生的机制是LSL2A的上游基因（如其转录因子）存在时空表达导致LSL2A的时空表达,从而产生红色斑点。斑点的形成是一个古老的事件,因为斑点存在于所有栽培莴苣、野莴苣以及分化更早的毒莴苣中。我们种植了上万个斑点植株,未发现红色植株的产生,表明该转录因子的高表达可能对莴苣具有较强的副作用。后期可通过组织培养的方法获得全红的回复突变体,应用于耐弱光高花青素含量莴苣品种的培育。