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目的：探讨骨不连瘢痕组织中是否存在一种细胞(NCs),具有间充质干细胞特性以及压应力刺激对NCs成软骨分化的影响。方法：1.骨不连细胞的分离、培养和鉴定收集人的骨不连瘢痕组织,采用组织块培养法并结合传代获取、纯化细胞,观察细胞形态和表面标志物的表达,从而对其鉴定。MTT法测定第3、5、9代细胞的增殖情况。2.骨不连细胞的多分化潜能的研究取生长良好的第3代到第5代的细胞,分别用成骨诱导培养基诱导、成脂诱导培养基及成软骨诱导培养基。于成骨诱导7天,行Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,于诱导14天,Western-blot检测ALP, OC, BSP的蛋白含量,于诱导21天,行茜素红钙结节染色；于成脂诱导14天,行油红O染色,并Western-blot检测LPL, PPARy2的蛋白含量；于成软骨诱导14天后,行番素红染色,并Western-blot检测COL Ⅱ, COLX, SOX9的蛋白含量。3.压应力对骨不连细胞成软骨分化影响的研究和分子机制探讨收集第三代到第五代细胞,分别给予10KPa,30KPa,50KPa,70KPa压应力刺激,应用MTT法检测细胞的增殖能力。于加压14天后细胞行Q-PCR检测ColⅡ、Col X. SOX9、TGFβ1的mRNA的含量。采用慢病毒载体介导con-shRNA及TGFβ1-shRNA感染NCs细胞,于96h后行GFP免疫荧光检测阳性率,并Western-blot检测TGFβ1表达量。对感染con-shRNA及TGFβ1-shRNANCs的NCs细胞分成三组,一组为感染con-shRNA未加压组,一组为感染TGFβ1-shRNA未加压组,剩余一组为感染TGFβ1-shRNA加压组。于培养后7天收集细胞行P-smad2,Smad2,TGFβ1,Col Ⅱ、Col X、SOX9蛋白量的表达。结果：1.经组织块培养法结合传代所得到的细胞形态均一,呈长梭形,接近融合状态时可呈现旋涡样生长,传第10代细胞的增殖能力减弱,出现宽大梭形,排列紊乱。90%以上的细胞表达CD29和CD44；小于8.5%的细胞表面表达CD34,CD45.经MTT方法检测,第5代细胞增殖能力最佳。2.骨不连细胞经成骨诱导后,细胞形态开始逐渐发生改变,局部变成多角形,宽大梭形,细胞内颗粒增多,最后成集落层叠生长,于诱导7天时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色阳性,诱导21天茜素红染色阳性,Western-Blot结果显示,高表达ALP,OC及BSP；经成脂诱导后细胞形态由长梭形逐渐变为圆形,短梭形,正方形,不规则形状,呈现“放射状触须”样改变,最后可见细胞内透亮的脂滴形成。于诱导14天油红O染色阳性,Western-Blot结果显示,高表达LPL及PPAR-γ2；经成软骨诱导后细胞形态逐渐变成圆形,椭圆形及多边形。诱导14天番素红染色阳性,Western-Blot结果显示,高表达Col Ⅱ. Col X和SOX9。3.骨不连细胞给予加压后细胞形态逐渐增大,成宽大形状,细胞分泌物增多,细胞质变得模糊。经MTT检查,细胞增殖能力增强。通过对骨不连干细胞的加压刺激作用,发现软骨细胞分化标志因子Col Ⅱ.Col Ⅹ、SOX9,TGFβ1的mRNA表达水平上调,并随着压力增大而上升。采用慢病毒载体介导TGFβ1-shRNA感染NCs细胞,通过GFP荧光检测显示,NCs细胞的慢病毒感染率达80%以上。Western blot检测TGFβ1表达效率。结果显示,与对照组(Con-shRNA)对比,TGFβ1表达显著抑制,证明慢病毒载体TGFβ1-shRNA能显著下调细胞中TGFβ1的表达。用TGFβ1-shRNA联合压应力处理细胞,发现压应力和TGFβ1-shRNA联合处理细胞后,压应力回复TGFβ1-shRNA对P-Smad2表达的抑制作用。同样回复TGFβ1-shRNA对成软骨细胞标志因子Col Ⅱ,Col Ⅹ,SOX9蛋白的抑制作用。结论：1.骨不连细胞NCs属于一种间充质干细胞,具有干细胞的表型及有多向分化能力。2.骨不连细胞NCs经间接压应力刺激后经TGFβ1-Smad2通路向成软骨方向分化。