鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG,)又称鸡败血霉形体,是引起鸡的慢性呼吸道疾病的主要病原,也是生物制品及活疫苗生产中支原体污染的一个重要污染源,建立一种有效的,特异性强的快速检测方法具有十分重要的意义。实时荧光定量PCR技术具有对病原快速做出诊断,特异性高、敏感性强,并可精确定量的特点,适宜运用于鸡毒支原体的检测及临床诊断中。本研究根据GenBank登录的MG16SrRNA、TM-1、PvpA三种基因序列,分别设计合成了三对引物。通过PCR扩增目的基因片段,并与pMD19-T vector载体连接,构建重组质粒,经双酶切、PCR以及测序鉴定表明该重组质粒序列正确,可作为标准质粒DNA。然后以构建好的标准质粒为模板进行荧光定量PCR扩增检测,在对反应条件和反应体系进行优化后,通过分析扩增曲线、标准曲线、熔解曲线,建立了以16SrRNA、TM-1、PvpA三种基因序列作为靶序列的MG SYBR GREEN实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,以16SrRNA基因为靶序列建立的实时荧光定量PCR检测法,其敏感性最高,最低检出量为8.56×101copy/μL; TM-1基因为靶基因的检测灵敏性次之,最低检出量为6.01×10copy/μL; PvpA基因为靶基因的检测敏感性为6.01×101copy/μL。并且与其他对照组无交叉反应。在对120份鸡胚(尿囊液)和60份活疫苗样品检测中,以16SrRNA标准质粒为靶标时,检出的污染率为47.2%(85/180);在以TM-1标准质粒为靶标时,检出的污染率为39.4%(71/180);在以PvpA标准质粒为靶标时,检出的污染率为37.2%(67/180)。证明了该方法具有良好的敏感性、特异性、重复性,而且快速、准确。可用于对鸡毒支原体培养物、组织样品及疫苗的快速定量检测。